補中益氣湯對潰瘍性結腸炎腸道NLRP3炎性體活性的調控研究.pdf

1、目的:近幾年，NOD樣受體被發(fā)現，NLR家族的典型代表NLRP3也得到深入研究，發(fā)現NLRP3炎性體在維持腸道穩(wěn)態(tài)及腸道炎癥發(fā)生過程中具有重要作用。文獻報道，NLRP3廣泛表達于胃腸粘膜的上皮細胞中，在T、B淋巴細胞內也有表達，能被各種類型的分子、細菌或病毒所激活，形成炎性體。腸上皮內NLRP3一旦監(jiān)測到病原體或危險信號，便在胞內經過招募ASC分子，激活caspase-1，“組裝”形成一種大分子蛋白復合體——inflammasome（炎

2、性體），進而激活細胞分泌IL-1β、IL-18、IL-33等促炎細胞因子，參與胞內炎癥反應和免疫應答，調節(jié)腸道穩(wěn)態(tài)。因此，研究NLRP3炎性體活化通路在UC急慢性病理演變中的變化規(guī)律，對于探討UC結腸粘膜急慢性炎癥發(fā)生發(fā)展的分子機制具有重要作用。
　　按照中醫(yī)觀點“虛則補之，實則瀉之”，“脾虛失健”是UC發(fā)病的根本病機，故益氣健脾為UC的基本治法。補中益氣湯是益氣健脾法的代表復方，具有補氣健脾、提升中氣的功效。本實驗采用補中益氣湯

3、治療小鼠UC，觀察NLRP3炎性體及其下游信號通路細胞因子的表達，以探討補中益氣湯防治UC的效應機制是否與調控腸道NLRP3炎性體活化通路有關，進一步指導臨床，為臨床應用益氣健脾治法提供科學依據。內容:
　　1.C57BL/6小鼠UC模型的建立及補中益氣湯的作用
　　潰瘍性結腸炎是以腹瀉、黏液膿血便、腹痛、里急后重為主要癥狀，反復發(fā)作，急慢性交替出現的腸道炎癥疾病。本實驗通過建立UC急慢性動物模型，觀察小鼠全身癥狀變化、腸道

4、變化（結腸長度、結腸重量）、病理性改變及炎癥性評分，評估該動物模型及補中益氣湯對UC小鼠的治療作用。
　　方法:
　　128只SPF級C57BL/6小鼠隨機分為正常組（32只）、模型對照組（32只）、補中益氣湯高劑量組（16只）、補中益氣湯中劑量組（16只）、補中益氣湯低劑量(16只)、陽性藥柳氮磺吡啶片對照組（16只），除正常組外其余各組采用3％DSS（分子量36000-50000單位）飲水1周造成結腸損傷，再恢復正常飲水

5、3周，在3周、4周每天給予補中益氣湯高、中、低劑量組及陽性藥柳氮磺吡啶片對照組小鼠相應藥物進行干預，分別于第1、2、3、4周4個時間點對小鼠進行動態(tài)觀察:小鼠糞便性狀改變;結腸長度及結腸重量變化;結腸病理變化;結腸黏膜炎癥評分。
　　結果:
　　與正常組相比，模型組結腸重量增加（P＜0.05），結腸長度縮短（P＜0.01），結腸黏膜炎癥評分明顯增高（P＜0.01）;造模2周后，結腸重量增加（P＜0.01），結腸長度減少（P＜

6、0.01），結腸黏膜炎癥評分增高（P＜0.01），造模后3、4周，結腸重量增加（P＜0.01），結腸長度縮短（P＜0.01），黏膜炎癥評分與正常組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。
　　2.補中益氣湯對UC小鼠結腸粘膜NLRP3、ASC、caspase-1的mRNA表達的作用
　　NLRP3廣泛地表達于胃腸粘膜的上皮細胞，并且在粒細胞及T、B細胞也有表達。NLRP3位于細胞胞質溶膠的模式識別受體(Pattern reco

7、gnition receptor PRR)，是胞質內感受外源性微生物或內源性危險信號的監(jiān)測器，能被各種類型的分子、細菌或病毒所激活，通過形成炎性體，參與腸道免疫和炎癥反應，介導機體固有免疫，在調節(jié)機體免疫、保持腸道穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。NLRP3炎性體由NLRP3支架、ASC和caspase-1三部分組成。本實驗通過補中益氣湯治療UC小鼠，觀察該復方藥對小鼠腸道NLRP3炎性體活化的調控作用。
　　方法:
　　采用實時熒光定量

8、PCR(real time PCR)檢測1、2、3、4周正常組與模型組、補中益氣湯高、中、低劑量組及陽性藥柳氮磺吡啶片對照組結腸粘膜NLRP3、ASC、Caspase-1mRNA的表達。并用SPSS13.0統(tǒng)計軟件統(tǒng)計。
　　結果:
　　1、2、3、4周模型組結腸粘膜中NLRP3 mRNA表達比空白對照組明顯增高（P＜0.05，P1=0.039; P2=0.031; P3=0.036;P4=0.044）;緩解期，模型組與其余

9、各組無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）;1、2、3、4周模型組結腸粘膜中ASC mRNA表達比空白對照組明顯增高（P＜0.05，P＜0.01，P1=0.039; P2=0.000; P3=0.002;P4=0.019）;緩解期，模型組與其余各組無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）;1、2、3、4周模型組結腸粘膜中caspase-1mRNA表達比空白對照組明顯增高（P＜0.05，P＜0.01，P1=0; P2=0.003;P3=0.028;P4=0.0

10、45）;緩解期，模型組與其余各組無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），但補中益氣湯高中低劑量組caspase-1 mRNA表達較模型組有下降的趨勢。
　　3.補中益氣湯對UC小鼠結腸粘膜及血漿細胞因子IL-1β、IL-18、IL-33的作用
　　激活的NLRP3炎性體可將無活性的pro-caspase-1轉化為活性的caspase-1，Caspases-1通過對pro(IL)-1β、pro-IL-18、pro-IL-33進行剪切、加

11、工，使之轉化成有生物活性的細胞因子。以形成活性形式并分泌及執(zhí)行一系列細胞程序，從而導致炎癥反應或細胞凋亡。IL-1β、IL-18、IL-33是重要的促炎反應介質，在潰瘍性結腸炎發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。本實驗通過ELISA方法檢測血漿及結腸粘膜細胞因子中IL-1β、IL-18、IL-33的含量，觀察補中益氣湯對NLRP3炎性體下游信號分子的調控作用。
　　方法:
　　每周結束后，取出不同組小鼠饑餓處理24小時，脫頸椎處死小

12、鼠，剖開腹部，剪取整段結腸，測量結腸長度，沿縱軸剪開，用自來水清洗兩遍，再用預冷的生理鹽水清洗，在濾紙上吸去水分，稱取凈重。并轉入勻漿器中加入10×PBS勻漿液充分勻漿，5000xg，4℃離心5min，取上清液用于檢測。采用眼球摘除方法收集小鼠血液，血液收集到預先準備好的EDTA抗凝劑試管，標本采集后30min內于4℃1000xg離心15min，取上清液，-20℃保存?zhèn)溆?。用ELISA方法檢測腸道粘膜及血漿中IL-1β、IL-18、IL

13、-33的含量。并用SPSS13.0統(tǒng)計軟件統(tǒng)計。
　　結果:
　　炎癥急性期，UC小鼠血漿及結腸粘膜中IL-1β含量增加，明顯高于正常組（P＜0.05，P＜0.01，P結腸=0.033，P血漿=0.002），緩解期，IL-1β含量下降，與正常組比較無顯著差異（P＞0.05）;造模后1、2、3周內，小鼠結腸粘膜IL-18表達水平較正常組均顯著升高（P＜0.05 P1=0.035，P2=0.018，P3=0.002），造模3周后

14、，補中益氣湯高中低劑量組IL-18在結腸粘膜的表達量比模型組顯著下降，（P＜0.05）;模型組小鼠血漿IL-18含量均較空白組顯著增高，（P＜0.05，P1=0.027，P2=0.029，P3=0.017，P4=0.018，P5=0.045，P6=0.032），3、4周補中益氣湯高中低劑量組小鼠血漿中IL-18含量較模型組有下降趨勢，以補中益氣湯中劑量組最為明顯(P＜0.05);造模1周，模型組結腸粘膜IL-33的表達顯著高于正常組（P

15、＜0.01，P=0.004），2、3、4周，模型組與其余各組沒有明顯差異（P＞0.05），補中益氣湯高中劑量組小鼠粘膜IL-33含量較模型組升高;1周血漿中IL-33含量較正常組明顯增高（P＜0.05，P=0.033），2、3、4周UC小鼠血漿IL-33水平接近正常組血漿IL-33水平，無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。
　　結論:
　　小鼠UC模型指標的動態(tài)監(jiān)測結果在一定程度上體現了DSS誘導的小鼠UC模型從急性到慢性的病理變