重組大腸桿菌發(fā)酵液中5-氨基乙酰丙酸的分離純化.pdf

1、5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid，ALA)是生物合成卟啉、血紅素、VB12等四吡咯類(lèi)化合物的中間體，在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥以及生物技術(shù)領(lǐng)域有著重要的應(yīng)用價(jià)值。目前，重組大腸桿菌發(fā)酵法生產(chǎn)ALA的技術(shù)已經(jīng)得到了廣泛的研究，但是從發(fā)酵液中分離純化ALA的工作鮮有報(bào)道。本文的研究目的即為建立一條從重組大腸桿菌發(fā)酵液中分離純化ALA的新工藝，并獲得高純度的產(chǎn)品，為其工業(yè)化生產(chǎn)奠定堅(jiān)實(shí)的技術(shù)基礎(chǔ)。
　　 本文以磷酸二(2

2、-乙基已基)酯(D2EHPA)為萃取劑，正已醇為稀釋劑，分別研究了D2EHPA的體積濃度、初始水相pH、初始ALA濃度、溫度、相比和級(jí)數(shù)對(duì)萃取平衡的影響。采用鹽酸對(duì)負(fù)載ALA的有機(jī)相反萃取，研究了鹽酸濃度、溫度、相比和級(jí)數(shù)對(duì)反萃取平衡的影響。確定了ALA萃取的較優(yōu)工藝條件：D2EHPA的體積濃度50％，萃取溫度20℃，初始水相pH6.5，相比R為0.5，二級(jí)萃??；反萃取溫度30℃，反萃取相鹽酸濃度1mol/L，相比r為0.5，一級(jí)反萃取

3、。
　　 研究了發(fā)酵液中ALA的粗分離工藝。采用中空纖維超濾膜組件處理帶菌的發(fā)酵液，超濾過(guò)程ALA的回收率為86.5％，脫色率為54.4％；超濾透過(guò)液用反滲透的方法除水濃縮，收率為93.2％。采用優(yōu)化后的工藝對(duì)反滲透濃縮液進(jìn)行萃取.-反萃取，ALA的總收率為79.8％，產(chǎn)物的HPLC純度為36.2％。研究了影響ALA分離的主要因素，分別采用延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間和活性炭脫色的方法降低前體和色素雜質(zhì)的含量。脫色過(guò)程ALA的回收率為99.3％

4、，脫色率為89.8％。粗分離工藝的ALA總回收率為63.9％。
　　 探索了5-氨基乙酰丙酸鹽酸鹽(ALA·HCl)的精制純化工藝。65℃下對(duì)反萃水相真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，產(chǎn)品回收率為99.2％。濃縮液冷卻結(jié)晶，一級(jí)結(jié)晶的收率為53.6％，兩級(jí)結(jié)晶的總收率為80.1％，精制純化過(guò)程的總回收率為79.5％，所得白色針狀晶體中ALA·HCl的實(shí)際純度為99.5％。重組大腸桿菌發(fā)酵液經(jīng)過(guò)膜分離、反應(yīng)萃取和濃縮結(jié)晶后，ALA·HCl的總收率