羥基磷灰石納米粒子抑制肝癌細(xì)胞增殖及其機(jī)理研究.pdf

1、納米粒子由于其獨(dú)特的納米生物學(xué)效應(yīng)，已成為目前腫瘤防治研究工作的熱點(diǎn)。羥基磷灰石納米粒子具有抗癌活性，又具有良好的生物相容性，因而在抗肝癌研究中，受到越來越多的關(guān)注。 本文選用均勻沉淀法成功制備出粒徑范圍主要為44.6nm～86.8nm(HAP<,1>)、 301.6nm～1339.3nm(HAP<,2>)、843.2nm-2443.0nm(HAP<,3>)三種羥基磷灰石粒子。用 0.14 mmol/L、0.28 mmol/L、

2、0.56 mmol/L的HAP<,1>納米粒子以及0.56 mmol/L濃度的HAP<,2>和HAP<,3>粒子與肝癌細(xì)胞作用，通過光鏡觀察和MTT法、生長曲線及集落形成率定量測(cè)定，結(jié)果顯示HAP<,1>納米粒子對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖能力有劑量和時(shí)間依賴性抑制作用，以0.56 mmol/L濃度處理肝癌細(xì)胞4d可達(dá)到顯著的抑制作用；而0.56 mmol/L濃度的HAP<,2>和HAP<,3>粒子對(duì)肝癌細(xì)胞的作用都很弱。由此推斷HAP<,1>納米

3、粒子的抑制肝癌細(xì)胞增殖作用與粒徑、濃度及作用時(shí)間有關(guān)，這為其體內(nèi)外抗癌研究提供了依據(jù)。 通過三種不同粒徑的HAP粒子與肝癌細(xì)胞相互作用，經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察與分析可知HAP<,1>納米粒子很容易與肝癌細(xì)胞膜結(jié)合，肝癌細(xì)胞以非網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞膜穴樣內(nèi)陷途徑胞吞HAP<,1>納米粒子進(jìn)入肝癌細(xì)胞，而HAP<,2>和HAP<,3>粒子不易與肝癌細(xì)胞膜結(jié)合，因而很少進(jìn)入肝癌細(xì)胞。通過Fluo-3熒光探針標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)游離Ca<'2+>，經(jīng)熒光顯微

4、鏡觀察，HAP<,1>納米粒子使肝癌細(xì)胞的熒光增強(qiáng)，這說明HAP<,1>納米粒子進(jìn)入肝癌細(xì)胞后，胞漿成份促進(jìn)其降解。 通過Feulgen染色、AgNOR染色以及免疫細(xì)胞化學(xué)PCNA染色，光鏡觀察以及圖像分析軟件的定量測(cè)定，HAP<,1>納米粒子使肝癌細(xì)胞的平均細(xì)胞核DNA含量下降、核仁內(nèi)AgNOR數(shù)量減少以及PCNA表達(dá)減弱，從分子生物學(xué)角度證實(shí)了HAP<,1>納米粒子體外抑制肝癌細(xì)胞的作用，同時(shí)也揭示了HAP<,1>納米粒子的

5、抑癌機(jī)理①通過抑制DNA合成，主要是通過抑制DNA合成過程中所需的DNA聚合酶PCNA的活性，干擾DNA的合成；②通過抑制rDNA的轉(zhuǎn)錄活性，抑制rRNA的合成，進(jìn)一步抑制細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成；⑧通過抑制PCNA的活性，影響細(xì)胞增殖周期的順利進(jìn)行，延長細(xì)胞增殖時(shí)間。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果也證實(shí)肝癌細(xì)胞被阻滯于增殖周期的G1期。 通過形態(tài)學(xué)觀察以及定量測(cè)試方法，可知HAP<,1>納米粒子體外抗肝癌作用緩慢，并不能快速殺死肝癌細(xì)胞，而首先

6、是作為一種抑制肝癌細(xì)胞增殖作用的藥物，通過逐漸影響其功能，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。推測(cè)HAPl納米粒子是通過其降解產(chǎn)物以及粒子本身共同影響細(xì)胞的功能，表現(xiàn)出肝癌細(xì)胞由局部到整體的超微結(jié)構(gòu)變化，最終誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞以非程序性死亡的方式死亡一脹亡。成功建立了符合肝癌形態(tài)學(xué)特征的人肝癌裸鼠移植瘤模型，采用瘤內(nèi)局部注射途徑，HAP<,1>納米粒子能明顯抑制肝癌移植瘤生長，治療1周和2周的抑瘤率分別為77.21％和51.32％。能明顯延長荷瘤鼠的生存時(shí)間。

7、對(duì)肝癌移植瘤組織做石蠟切片，F(xiàn)eulgen染色、AgNOR染色以及免疫組織化學(xué)PCNA染色，通過光鏡觀察和圖像分析軟件定量測(cè)定，HAP<,1>納米粒子使移植瘤組織肝癌細(xì)胞的平均核DNA含量下降、核仁內(nèi)AgNOR數(shù)量減少以及PCNA表達(dá)減弱，從分子生物學(xué)角度證實(shí)HAP<,1>納米粒子能明顯抑制移植瘤的肝癌細(xì)胞增殖，同時(shí)也揭示了抑制機(jī)理。 通過電鏡觀察發(fā)現(xiàn)移植瘤組織的肝癌細(xì)胞內(nèi)有HAP<,1>納米粒子，推測(cè)其與進(jìn)入體外培養(yǎng)肝癌細(xì)胞的

8、方式相同，并在胞質(zhì)內(nèi)降解，可能同樣是以降解產(chǎn)物及粒子本身影響細(xì)胞的功能，最終導(dǎo)致移植瘤組織的肝癌細(xì)胞死亡。由于體內(nèi)是實(shí)體瘤組織，HAP<,1>納米粒子在肝癌組織的濃度高低分布不同，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞以程序性以及非程序性兩種方式死亡一凋亡及胞體割裂。 總之，HAP<,1>納米粒子體內(nèi)抗肝癌的機(jī)理是：首先，①抑制肝癌細(xì)胞增殖，通過抑制DNA合成，主要是抑制DNA合成過程中所需的DNA聚合酶PCNA的活性，干擾DNA的合成。通過抑制rDNA