載脂蛋白M定點(diǎn)誘變及其生物學(xué)功能檢測(cè).pdf

1、目的:對(duì)人ApoM基因定點(diǎn)誘變，構(gòu)建ApoM野生型和突變型原核、真核表達(dá)載體，并檢測(cè)其生物學(xué)功能。
　　方法: Trizol法抽提肝L02細(xì)胞總RNA，RT-PCR擴(kuò)增ApoM全長(zhǎng)基因，將基因片斷重組到PMD18-T質(zhì)粒中構(gòu)建PMD18-T-ApoM重組質(zhì)粒載體，轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌 JM109后篩選陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒酶切和測(cè)序鑒定。采用sited-directed mutagenesis試劑盒對(duì)ApoM基因進(jìn)行體外定點(diǎn)誘變，DNA測(cè)

2、序鑒定定點(diǎn)誘變成功與否。用雙酶切方法分別將ApoM野生型和突變型基因定向連接到原核表達(dá)載體pGEX-KG和真核表達(dá)載體pEGFP-N3中，構(gòu)建野生型和突變型原核表達(dá)質(zhì)粒 pGEX-KG-ApoM和真核表達(dá)質(zhì)粒 pEGFP-N3-ApoM，分別轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌DH5α內(nèi)，提取質(zhì)粒酶切鑒定和測(cè)序鑒定。將構(gòu)建的原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-KG-ApoM轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DE3(BL21)，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果顯示，野生型原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-

3、KG-ApoM能高效表達(dá)ApoM融合蛋白。將構(gòu)建的野生型和突變型真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-N3-ApoM瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入7402細(xì)胞中，利用western blot技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后的7402細(xì)胞ApoM蛋白表達(dá)水平，利用3H標(biāo)記的膽固醇體外利用實(shí)驗(yàn)、THP-1細(xì)胞參與的膽固醇流出實(shí)驗(yàn)以及CuSO4參與抗氧化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)野生型和突變型ApoM蛋白生物學(xué)功能間差異。結(jié)果成功克隆 ApoM全長(zhǎng)基因并構(gòu)建野生型和突變型ApoM原核、真核表達(dá)載體。Wester

4、n blot結(jié)果顯示，野生型原核表達(dá)質(zhì)粒能高效表達(dá)ApoM融合蛋白。轉(zhuǎn)染真核野生型ApoM重組質(zhì)粒的7402細(xì)胞用WB檢測(cè)，ApoM蛋白表達(dá)水平增強(qiáng)，而轉(zhuǎn)染空載體組、空脂質(zhì)體組、和突變型ApoM真核表達(dá)質(zhì)粒組的ApoM蛋白表達(dá)水平均較低。在THP-1細(xì)胞參與的膽固醇流出實(shí)驗(yàn)中，與空載體組、空脂質(zhì)體組、和ApoM突變載體組比較，野生型載體組具有明顯的促進(jìn)膽固醇從泡沫細(xì)胞中流出的作用，差異具有顯著性（P＜0.05）；ApoM突變型載體組、空

5、載體組和空脂質(zhì)體組之間，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。在 CuSO4參與的抗氧化實(shí)驗(yàn)中，
　　結(jié)果:顯示，ApoM野生型真核表達(dá)質(zhì)粒表達(dá)的蛋白與ApoM突變型真核表達(dá)質(zhì)粒表達(dá)的蛋白相比，前者的抗氧化能力明顯的強(qiáng)于后者而突變型組，差異具有顯著性（P＜0.05）；ApoM突變型重組質(zhì)粒、空載體組和空脂質(zhì)體組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　結(jié)論:通過(guò) RT-PCR、定點(diǎn)誘變及基因重組技術(shù)成功構(gòu)建野生型和突變型重組表

6、達(dá)質(zhì)粒。通過(guò)轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，野生型原核表達(dá)質(zhì)粒能高效表達(dá)ApoM融合蛋白。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 ApoM野生型真核表達(dá)質(zhì)粒后的7402細(xì)胞可以有效地高表達(dá)ApoM蛋白，而ApoM突變型真核表達(dá)質(zhì)粒組的ApoM蛋白表達(dá)水平均較低。在膽固醇流出和抗氧化實(shí)驗(yàn)中，野生型重組體組具有明顯的促進(jìn)膽固醇從由THP-1細(xì)胞轉(zhuǎn)化的泡沫細(xì)胞中流出和抗氧化作用而ApoM突變型重組體組的這些功能明顯減弱或喪失，為進(jìn)一步研究ApoM在脂質(zhì)代謝、在CHD發(fā)生發(fā)展中的作用奠定了基礎(chǔ)。