c-Ab1非受體酪氨酸激酶介導的FoxM1磷酸化及其功能研究.pdf

1、非受體酪氨酸激酶c-Abl廣泛存在于哺乳動物各種組織細胞中，通過介導底物蛋白發(fā)生酪氨酸磷酸化修飾，參與細胞增殖、細胞周期、細胞凋亡、DNA損傷修復、炎癥反應、腫瘤發(fā)生形成等生命過程的調(diào)控。在正常生理條件下，c-Abl的激酶活性受到嚴謹調(diào)控，被多種細胞因子、氧化應激或DNA損傷應激激活后的c-Abl激酶活性大大提高，通過定位于不同的細胞亞結(jié)構(gòu)發(fā)揮不同的生理功能。c-Abl具有重要的功能結(jié)構(gòu)域，其SH3結(jié)構(gòu)域能識別富含脯氨酸的蛋白基序，與底

2、物結(jié)合密切相關;其SH2結(jié)構(gòu)域能夠識別磷酸化的酪氨酸殘基基序;NLS及NES結(jié)構(gòu)域引導c-Abl在細胞核質(zhì)間穿梭，發(fā)揮不同的生理功能。
　　轉(zhuǎn)錄因子FoxM1屬于FOX家族，它在DNA結(jié)合區(qū)域上呈翼狀螺旋結(jié)構(gòu)，在不同的細胞周期時相中，其表達水平及轉(zhuǎn)錄激活活性不同，能夠調(diào)控細胞周期特異性基因的轉(zhuǎn)錄表達，從而參與細胞增殖、細胞周期調(diào)控及DNA損傷修復等過程。c-Abl與FoxM1均密切參與細胞增殖、細胞周期調(diào)控、細胞信號轉(zhuǎn)導等生理活動

3、，兩者之間是否存在聯(lián)系值得探討。
　　本研究將就二者間的相互作用、磷酸化修飾、穩(wěn)定性調(diào)節(jié)、泛素化修飾降解及其對細胞周期進程的影響等方面進行深入研究。
　　本研究通過免疫共沉淀及免疫印跡證實，c-Abl及FoxM1在人乳腺癌細胞MCF-7內(nèi)能形成免疫復合物，異源表達的Flag-FoxM1及Myc-c-Abl也存在相互作用，且其相互作用不依賴于c-Abl的激酶活性。通過進一步研究發(fā)現(xiàn)c-Abl通過SH2、SH3結(jié)構(gòu)域與FoxM1

4、相結(jié)合，且SH2結(jié)構(gòu)域的結(jié)合能力更強。由于SH2結(jié)構(gòu)域能夠識別磷酸化的酪氨酸殘基序列，提示FoxM1上有酪氨酸磷酸化位點。為此，我們對其酪氨酸磷酸化修飾作進一步研究。
　　通過免疫共沉淀及抗酪氨酸磷酸化抗體檢測發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxM1能被c-Abl酪氨酸磷酸化。細胞周期同步化后發(fā)現(xiàn)FoxM1酪氨酸磷酸化修飾主要發(fā)生于細胞有絲分裂期，提示c-Abl介導的酪氨酸磷酸化修飾可能參與了FoxM1在細胞有絲分裂期的功能調(diào)控。隨后，質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)Fox

5、M1存在5個酪氨酸磷酸化位點，分別為Y129、Y272、Y317、Y377和Y590。通過構(gòu)建磷酸化位點突變體，發(fā)現(xiàn)與野生型FoxM1相比，各突變體的磷酸化水平均有不同程度減弱，其中Y272F與Y590F突變體的磷酸化水平減弱最明顯，僅為野生型的10％，提示這兩個位點是c-Abl介導的主要磷酸化修飾位點。我們接下來的研究工作也將主要圍繞這兩個磷酸化位點展開。
　　研究過程中發(fā)現(xiàn)，在293FT細胞中過表達Myc-c-Abl能夠顯著提

6、高FoxM1在細胞中的表達水平;并且在小鼠胚胎成纖維細胞中，當c-Abl及其相關基因Arg雙敲除后，F(xiàn)oxM1的半衰期縮短，提示c-Abl對維持FoxM1的穩(wěn)定性有重要作用。隨后我們發(fā)現(xiàn)，c-Abl能夠顯著抑制FoxM1的泛素化修飾，并且這種抑制作用依賴c-Abl激酶活性。進一步對FoxM1磷酸化突變體的泛素化修飾進行研究后發(fā)現(xiàn)，與野生型FoxM1相比，Y272F與Y590F磷酸化突變體的泛素化修飾明顯增強;且Y272/590F雙突變體

7、的泛素化水平增強尤為顯著。上述結(jié)果進一步說明，c-Abl介導的FoxM1酪氨酸磷酸化可抑制其泛素化修飾。
　　隨后，我們對FoxM1磷酸化位點突變導致泛素化水平增加的分子機制進行更深入的探討，發(fā)現(xiàn)FoxM1酪氨酸磷酸化位點突變后，與APC/C E3泛素連接酶組份Cdh1的結(jié)合作用顯著增強。Cdh1能夠識別并招募FoxM1通過泛素—蛋白酶體途徑降解。至此，我們提出c-Abl促進FoxM1穩(wěn)定性的機制，即c-Abl通過酪氨酸磷酸化修飾

8、，抑制FoxM1與E3泛素連接酶招募分子Cdh1的結(jié)合，并進一步抑制FoxM1經(jīng)泛素—蛋白酶體途徑降解，提高FoxM1在細胞內(nèi)的穩(wěn)定性。
　　c-Abl介導的FoxM1酪氨酸磷酸化修飾對細胞周期進程同樣具有調(diào)控作用。通過流式細胞技術檢測細胞周期發(fā)現(xiàn)，表達Flag-FoxM1Y590F突變體細胞的有絲分裂起進程顯著縮短，且其細胞周期依賴性蛋白Cyclin B1在有絲分裂期的降解顯著加快。這一結(jié)果提示，c-Abl對FoxM1的磷酸化修

9、飾可顯著影響FoxM1對細胞周期的調(diào)控作用，具體的機制有待深入研究。
　　綜合以上結(jié)果，本研究主要進展如下:
　　1）c-Abl與FoxM1能夠在細胞內(nèi)/外相互作用形成復合物;
　　2）c-Abl可介導FoxM1發(fā)生酪氨酸磷酸化修飾，且修飾主要發(fā)生在有絲分裂期;
　　3）質(zhì)譜鑒定并通過點突變證實FoxM1的Y129、Y272（通過磷酸化數(shù)據(jù)庫檢索發(fā)現(xiàn)）、Y317、Y377及Y590位點可被酪氨酸磷酸化修飾，Y27

10、2和Y590為主要磷酸化位點;
　　4）c-Abl介導的酪氨酸磷酸化能夠提高FoxM1在細胞中表達水平，并提高其穩(wěn)定性;
　　5）c-Abl介導的酪氨酸磷酸化能夠顯著抑制FoxM1的泛素化修飾;6）c-Abl介導的酪氨酸磷酸化通過抑制APC/C E3泛素連接酶組份Cdh1對FoxM1的識別招募，進而抑制FoxM1的泛素化修飾;7）表達FoxM1Y590F磷酸化突變體的細胞有絲分裂進程顯著加快，提示FoxM1Y590F較野生型

11、FoxM1可能具有更高的轉(zhuǎn)錄激活活性。
　　本研究首次證實非受體酪氨酸激酶c-Abl與FoxM1之間存在相互作用，并首次證實轉(zhuǎn)錄因子FoxM1能夠被酪氨酸磷酸化修飾。c-Abl介導的FoxM1酪氨酸磷酸化具有雙向調(diào)節(jié)作用:一方面可抑制其與Cdh1的結(jié)合，進而抑制FoxM1經(jīng)泛素—蛋白酶體途徑降解，提高FoxM1在細胞內(nèi)的穩(wěn)定性;另一方面，也會在一定程度上抑制，F(xiàn)oxM1的轉(zhuǎn)錄激活活性。這兩方面的調(diào)控作用相互制約，實現(xiàn)對細胞周期進程