天然食品防腐劑人溶菌酶編碼基因的克隆及其在畢赤酵母中的表達(dá).pdf

1、人溶菌酶是存在于人體正常體液和組織中的一種非特異性免疫因子.它對人體完全無毒副作用,同時具有抗菌、消炎、抗病毒、抗腫瘤等作用,可被開發(fā)成口含片、膠囊、口香糖及口腔噴霧劑等產(chǎn)品形式.由于人溶菌酶來源有限,因此該研究提出通過遺傳工程方法,利用畢赤酵母細(xì)胞生產(chǎn)人溶菌酶,一方面解決了人溶菌酶資源稀缺的問題,另一方面則能創(chuàng)造更大的經(jīng)濟(jì)效益.由于人胎盤組織中富含hLZM基因的mRNA,因此從人胎盤組織中提取細(xì)胞總RNA作為模板,根據(jù)GENEBANK

2、中已發(fā)表的hLZM基因的cDNA序列,設(shè)計(jì)合成特異引物,經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成hLZM基因的cDNA序列,并以此cDNA序列為模板,經(jīng)PCR擴(kuò)增hLZM編碼基因.經(jīng)DNA序列分析證明與已發(fā)表的hLZM cDNA序列完全一致.通過EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切作用,將hLZM的編碼基因按照質(zhì)粒閱讀框的轉(zhuǎn)譯方向插入到表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K的MCS中,構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K/hLZM.利用電轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化表型為His<'->的宿主菌KM71,利用MD培養(yǎng)

3、基篩選到近1 200個His<'+>轉(zhuǎn)化子.再經(jīng)G418抗性的二次篩選,獲得15株含高拷貝人溶菌酶基因的重組畢赤酵母轉(zhuǎn)化子.當(dāng)以甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)時,成功獲得了1株高效分泌表達(dá)的重組菌株P(guān)p135,其表達(dá)量為317mg/L,酶活性為32 035u/mL.菌株P(guān)p135經(jīng)甲醇誘導(dǎo),可將人溶菌酶分泌到培養(yǎng)基中,因此可在發(fā)酵上清液中直接檢測到人溶菌酶的活性.該檢測采用以溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)為試驗(yàn)菌的瓊

4、脂平板擴(kuò)散法.研究發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基BGMM、BMM、MMC等均能誘導(dǎo)菌株P(guān)p135表達(dá)人溶菌酶,由于培養(yǎng)基BGMM和MMC中存在干擾溶菌酶純化的雜蛋白,并使溶菌酶產(chǎn)品帶有異味和色素,因而確定利用BMM培養(yǎng)基進(jìn)行重組菌株P(guān)p135的誘導(dǎo)表達(dá).實(shí)驗(yàn)最終獲得381mg/L的表達(dá)量,若繼續(xù)優(yōu)化發(fā)酵條件,還有可能進(jìn)一步提高菌株P(guān)p135的表達(dá)水平.該研究為人溶菌酶的工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)奠定理論基礎(chǔ),這對帶動人溶菌酶的規(guī)模化生產(chǎn)具有特殊意義,其推廣應(yīng)用將給社會