人鳥(niǎo)氨酸脫羧酶抗酶1的抗體制備.pdf

1、目的:OAZ1(Ornithine Decarboxylase Antizyme1,鳥(niǎo)氨酸脫羧酶抗酶1)是多胺誘導(dǎo)的一種能負(fù)反饋調(diào)控多胺合成和多胺運(yùn)輸?shù)牡鞍?通過(guò)多種途徑在多胺代謝內(nèi)外發(fā)揮著抗腫瘤效應(yīng),可望成為抗腫瘤治療的新靶點(diǎn)。目前,沒(méi)有市售的OAZ1單抗。購(gòu)買的OAZ1多抗價(jià)格昂貴、特異性差,不能滿足實(shí)驗(yàn)需求。本課題計(jì)劃制備 HOAZ1(Homo sapiens Ornithine Decarboxylase Antizyme1,人

2、鳥(niǎo)氨酸脫羧酶抗酶1)的多克隆抗體和單克隆抗體,為進(jìn)一步研究 HOAZ1的新功能和抗腫瘤機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　方法:(1)用巢式-PCR和重疊延伸-PCR克隆 HOAZ1基因的+1移碼位點(diǎn) T205缺失突變的開(kāi)放性閱讀框 DM-HOAZ1和S-HOAZ1,分別構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒和真核表達(dá)質(zhì)粒。(2)將原核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 Rosseta(DE3),用IPTG誘導(dǎo)目的基因表達(dá)。通過(guò)超聲裂解和SDS-PAGE檢測(cè)重組蛋白的可溶性。經(jīng) Ni-NT

3、A親和層析純化目的蛋白, SDS-PAGE檢測(cè)純化情況,Western Blotting鑒定重組蛋白。(3)將純化并透析、濃縮的HOAZ1重組蛋白免疫 Balb/C小鼠,取效價(jià)最高的小鼠血清作為多克隆抗體。分離該小鼠脾細(xì)胞,并與骨髓瘤細(xì)胞 SP2/0融合。通過(guò) HAT選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)、間接 ELISA法篩選、用有限稀釋法單克隆化,獲得穩(wěn)定分泌特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞株。將陽(yáng)性單克隆細(xì)胞移植至小鼠腹腔,收獲腹水上清作為單克隆抗體。用間接 E

4、LISA檢測(cè)抗體的效價(jià),Western Blotting檢測(cè)抗體的特異性。(4)將制備的抗體應(yīng)用于 Western Blotting,檢測(cè)真核細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)和本底表達(dá)的HOAZ1蛋白。
　　結(jié)果:利用PCR定點(diǎn)誘變和基因工程技術(shù)成功構(gòu)建了無(wú)需+1RF翻譯就能連續(xù)編碼長(zhǎng)短兩型 HOAZ1蛋白的表達(dá)質(zhì)粒。經(jīng)原核表達(dá)包涵體形式和可溶性形式的6×His重組蛋白,并用Ni-NTA親和層析分別在變性條件和天然條件下純化獲得純度在80％以上的兩

5、種異型體蛋白,純化的蛋白兼有6×His及OAZ1抗原表位。將變性條件下純化并透析、濃縮的HOAZ1全長(zhǎng)型重組蛋白作為抗原免疫 Balb/C小鼠、天然條件下純化的HOAZ1全長(zhǎng)型重組蛋白作為間接 ELISA的包被抗原,制備獲得抗血清形式的多抗和陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株2F3G2A5腹水上清形式的單抗,效價(jià)分別為1:256000和1:8000。多抗和單抗均不是6×His標(biāo)簽抗體,均能用于 ELISA和Western Blotting檢測(cè)原核表達(dá)的長(zhǎng)