RNA結(jié)合蛋白LIN28在男胎原始生殖細(xì)胞中的表達(dá).pdf_第1頁
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文檔簡介

1、日益增高的不孕不育發(fā)生率對人類的健康和生存構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。臨床上,不孕癥和胚胎早期自然流產(chǎn)、人工助孕不明原因的失敗、胎兒遺傳疾病及育齡婦女多囊卵巢綜合征等生殖方面疾病逐年增多,已成為困擾人們身心健康的世界性問題,也是當(dāng)今生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)問題。除了生殖功能后天的損傷和污染的影響,胚胎獲得性缺陷也占一個(gè)很高的比例。有些數(shù)據(jù)表明,這些病因未明的胚胎獲得性缺陷與性腺發(fā)育異常及相關(guān)基因的缺陷有關(guān)。生殖細(xì)胞是性腺的重要組成部分,它們的形成和擴(kuò)增在

2、性腺發(fā)育中起決定作用,進(jìn)而影響繁衍生殖的功能。
  人類原始生殖細(xì)胞(primordial germ cells,PGCs)是包括卵子和精子在內(nèi)的各型生殖細(xì)胞的共同起源細(xì)胞(祖細(xì)胞),PGCs與生殖發(fā)育密切相關(guān),在人類的生存和發(fā)展進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。在妊娠期2-3周,人類早期胚胎開始出現(xiàn)PGCs,定位在胚胎的尿囊和間質(zhì)的上胚層。到妊娠期的5-6周,PGCs遷徙到原始生殖嵴。遷移后的PGCs經(jīng)過一系列的擴(kuò)增與初始分化,形成約5-7百

3、萬個(gè)卵原或精原細(xì)胞,這些原始細(xì)胞被支持細(xì)胞和體細(xì)胞圍繞,共同組成早期性腺。PGCs的成熟過程呈階段性發(fā)展并被精密地調(diào)控著。本實(shí)驗(yàn)主要就遷移后的原始生殖細(xì)胞進(jìn)行研究,這個(gè)時(shí)期是細(xì)胞的增殖和性別分化的決定時(shí)期,是由細(xì)胞內(nèi)外因素共同調(diào)控的。通過體外誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化為生殖干細(xì)胞,科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)主要的外部因素骨成形素蛋白(Bone Morphogenetic Protein,BMP)。而內(nèi)在因素是一系列內(nèi)源性機(jī)制調(diào)控不同基因,按照特定的時(shí)間和空間

4、嚴(yán)格表達(dá),以確保原始生殖細(xì)胞生成的正?;顒?dòng)。內(nèi)源性機(jī)制主要包括四個(gè)方面:RNA結(jié)合蛋白(RNA-binding Protein,RBP)調(diào)控,轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控、全能性基因調(diào)控和表觀遺傳調(diào)控。本實(shí)驗(yàn)選擇RNA結(jié)合蛋白LIN28及標(biāo)記蛋白OCT4進(jìn)行研究。
  LIN28是一種高度保守的RNA結(jié)合蛋白,是生殖細(xì)胞增殖和分化過程中必不可少的因子,并與人類睪丸生殖細(xì)胞腫瘤的發(fā)生與惡變密切相關(guān)。通過對小鼠的研究,發(fā)現(xiàn)LIN28高度表達(dá)在小鼠胚胎

5、干細(xì)胞和早期胚胎發(fā)育過程。體外誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),LIN28在人胚胎干細(xì)胞中高度表達(dá),并且可以提高誘導(dǎo)多能干細(xì)胞向生殖干細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率。而八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子4(Octamer-binding Transcription Factor 4,OCT4),一個(gè)著名的早期生殖細(xì)胞標(biāo)記物,在維持胚胎干細(xì)胞的多能性和自我更新方面起關(guān)鍵作用。因其在孕早期性腺中特異地高表達(dá),OCT4常用于目前生殖領(lǐng)域的研究標(biāo)記。然而目前為止,還沒有發(fā)現(xiàn)其他穩(wěn)定的指標(biāo)為判斷胎

6、兒生殖細(xì)胞的不同發(fā)育階段提供依據(jù)。為此,我們選擇多能性標(biāo)記物L(fēng)IN28與OCT4相比較。尋找適用于生殖細(xì)胞發(fā)育的不同階段正確的標(biāo)記物,從而揭示人類生殖細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)育、成熟及受精的調(diào)節(jié)機(jī)制是診斷和治療不孕不育癥和提高優(yōu)生優(yōu)育的基礎(chǔ)和關(guān)鍵,也將為當(dāng)今治療不孕癥的主要手段——輔助生育技術(shù)提供重要理論依據(jù),并有助于創(chuàng)立新的避孕措施。
  目的:
  本課題通過對男胎早期性腺組織中生殖細(xì)胞特異性因子的檢測,分析LIN28和OCT4在

7、原始生殖細(xì)胞的表達(dá)變化趨勢,探索OCT4和LIN28蛋白在胎兒發(fā)育初期過程中的表達(dá)功能和作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)?zāi)康?為進(jìn)一步研究PGCs的形成及增殖,理解生殖細(xì)胞和早期胎兒發(fā)育。以探討不孕不育、胎兒發(fā)育及遺傳缺陷主要成因,為不孕、胚胎移植失敗、流產(chǎn)和遺傳病的診斷和防治提供理論依據(jù)。
  材料與方法:
  收集棄之不用的6-20周的多胎妊娠減胎標(biāo)本、流產(chǎn)和引產(chǎn)標(biāo)本的人類胎兒睪丸組織共20例,進(jìn)行快速冰凍切片和免疫組織化學(xué)熒光染色測定組

8、織LIN28和OCT4。使用激光共聚焦顯微鏡拍照并統(tǒng)計(jì)LIN28和OCT4陽性細(xì)胞。將標(biāo)本按胎齡(7周、8周、9周、10周、11-12周、13-14周)分為6組(未發(fā)現(xiàn)兩種因子的6周減胎標(biāo)本和只有LIN28單因子表達(dá)的20周引產(chǎn)組織不納入其中),每組n=3,分別統(tǒng)計(jì)不同時(shí)期兩種因子的表達(dá)變化及趨勢。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以(x)±s形式來表示。定量資料符合正態(tài)分布和方差齊性的采用one-wayANOVA分析。應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

9、。以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。
  結(jié)果:
  1.LIN28在胎兒睪丸發(fā)育7-20周的PGCs中高度表達(dá)
  胎兒睪丸組織的免疫組化熒光染色顯示了妊娠7-14孕周胎兒睪丸組織中存在LIN28和OCT4蛋白的高度表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)這些OCT4-標(biāo)記的陽性細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上具有生殖母細(xì)胞的典型特征:圓形、規(guī)則細(xì)胞核,較高的核質(zhì)比。將這些陽性細(xì)胞認(rèn)定為PGCs。
  2.LIN28和OCT4相對表達(dá)水平的變化
  隨著胎

10、兒睪丸發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期,LIN28的表達(dá)量逐漸增高,而在胎齡11周后,早期標(biāo)記蛋白OCT4陽性細(xì)胞就不斷減少,到胎齡13周時(shí),已經(jīng)很少被觀測到。在胎齡20周的睪丸組織中,只有LIN28的表達(dá)可以在免疫組化結(jié)果中觀測到。
  3.LIN28在PGCs中表達(dá)的亞細(xì)胞定位變化
  標(biāo)記蛋白OCT4在早期胚胎發(fā)育過程中的表達(dá)一直定位在PGCs的細(xì)胞核中。而對于LIN28,定位是變化的。在胎齡第7周,同樣表達(dá)在PGCs的胞核內(nèi)。在第8-

11、9周,開始檢測到生殖細(xì)胞胞核和胞質(zhì)中均表達(dá)LIN28,而10周后,出現(xiàn)部分只在胞質(zhì)中的陽性細(xì)胞。最后,妊娠第11-13周及20周,基本所有的LIN28陽性細(xì)胞都定位在細(xì)胞質(zhì)中。
  4.LIN28和OCT4在人類原始生殖細(xì)胞中存在共定位
  當(dāng)PGCs在一個(gè)時(shí)段同時(shí)表達(dá)兩個(gè)蛋白,即熒光下紅色(LIN28)與綠色(OCT4)雙染色時(shí),我們認(rèn)為這兩個(gè)因子在這個(gè)時(shí)期的特定細(xì)胞中共表達(dá)。在亞細(xì)胞水平(胞核或胞質(zhì)),如果共表達(dá)的兩個(gè)對

12、象在胞內(nèi)分布有重疊,我們稱為共定位,那么至少為兩者可能存在的相互作用提供了一個(gè)必要條件。最初,大約60%陽性細(xì)胞在細(xì)胞核中共同表達(dá)兩個(gè)蛋白LIN28和OCT4。然后,這個(gè)比例逐漸增高,在胎齡11周的組織中,共表達(dá)比例達(dá)到100%。由于LIN28表達(dá)表型的變化以及OCT4核定位的穩(wěn)定性,在7-10周的部分細(xì)胞中兩個(gè)因子共定位于胞核。
  結(jié)論:
  RNA結(jié)合蛋白LIN28是一個(gè)可行的、穩(wěn)定的雄性原始生殖細(xì)胞標(biāo)記因子。

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