基于色譜聯(lián)用技術(shù)的蛇床子及其復方制劑中多組分同時分析與藥物代謝動力學研究.pdf

1、本研究首先建立了同時測定蛇床子中16種活性成分的LC-ESI-MS/MS分析方法，該方法可用于蛇床子藥材的全面質(zhì)量控制，提高了蛇床子藥材的質(zhì)量控制水平;在本研究中，還建立了靈敏度高，專屬性強的UPLC-ESI-MS/MS法同時測定大鼠血漿樣品中花椒毒素、異茴芹內(nèi)酯、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素、蛇床子素和異歐前胡素等6種香豆素類活性成分，并將該方法應用于大鼠灌胃給予蛇床子提取物后血漿中6種成分的藥代動力學研究，為中藥材蛇床子的臨床應用提供參考依

2、據(jù);還建立了同時測定八子補腎膠囊中14種活性成分的UPLC-ESI-MS/MS定量分析方法，并應用于八子補腎膠囊的質(zhì)量控制;建立了同時測定蛇床子中7種香豆素類活性成分的GC-MS-SIM定量分析方法，為中藥材蛇床子的質(zhì)量控制提供新的分析手段;采用UPLC-Q-TOF-MS/MS分析技術(shù)，對大鼠灌胃給予佛手柑內(nèi)酯后尿液和膽汁樣品中的代謝產(chǎn)物進行了鑒定研究，推測出佛手柑內(nèi)酯在大鼠體內(nèi)的代謝規(guī)律和主要代謝途徑，為佛手柑內(nèi)酯的臨床應用提供重要參

3、考。本文主要從以下幾部分展開論述:
　　第一部分 HPLC-ESI-MS/MS法同時測定蛇床子中16種活性成分的含量及其質(zhì)量表征
　　目的:建立一種快速、準確的LC-ESI-MS/MS定量分析方法，可同時分離、測定不同來源的蛇床子藥材中16種活性成分（9種香豆素類，包括蛇床子素、花椒毒酚、異補骨脂素、異茴芹內(nèi)酯、佛手柑內(nèi)酯、花椒毒素、二氫歐山芹素、歐前胡素和異歐前胡素;7種黃酮類，包括山奈酚、異鼠李素、槲皮苷、木犀草素、槲皮

4、素、橙皮苷和蘆?。⒂糜?2批不同來源蛇床子藥材的質(zhì)量分析。
　　方法:液相色譜柱Waters XBridge C18柱（250×4.6 mm，5μm）;流動相為A:乙腈，B:水（含有0.1％乙酸），梯度洗脫，分析時間為15 min，流速為1.0 mL/min。質(zhì)譜采用電噴霧離子源（ESI源），TurboV離子源，源溫度(TEM)550℃，采用多反應離子監(jiān)測(MRM)，進行正負離子同時檢測。源噴射電壓(IS)為4500 V和-4

5、500 V，霧化溫度為650℃，霧化氣(GS1，N2)為50 psi，輔助氣(GS2，N2)為60 psi，氣簾氣(N2)為25 psi。接口持續(xù)加熱，全程氮氣通入狀態(tài)。每個離子對的滯留時間為40 ms。DP為10/-10 V;CXP為5/-5 V。全掃描相對分子量范圍為100～1000。
　　結(jié)果:16種活性成分的線性關(guān)系良好（r2≥0.9987），檢測限和定量限分別為1.71～7.29 ng/mL和5.10～20.01 ng/

6、mL。日內(nèi)日間精密度分別為0.5～3.6％和0.6～3.5％。穩(wěn)定性和重復性的相對標準偏差分別為0.5～3.9％和0.5～3.2％。平均回收率范圍在96.89％～101.6％。
　　結(jié)論:本研究首次建立了HPLC-ESI-MS/MS法，采用在一個分析周期內(nèi)正負離子多次切換的檢測模式，同時定性和定量分析蛇床子藥材中16種有效成分，并將該方法應用于12批不同來源藥材的質(zhì)量分析，該方法操作簡便、快速、靈敏度高、專屬性強，可為蛇床子藥材的

7、質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。從樣品的含量測定結(jié)果來看，各產(chǎn)地之間12批次蛇床子藥材的質(zhì)量差異大，提示藥材質(zhì)量受產(chǎn)地及其種植地天氣狀況等的影響。因而有必要對藥材的產(chǎn)地及采集等進行跟蹤檢測，以保證蛇床子藥材質(zhì)量和藥效的穩(wěn)定。
　　第二部分 UPLC-ESI-MS/MS法同時測定大鼠口服蛇床子提取物后血漿中6種成分及藥代動力學研究
　　目的:建立一種同時測定大鼠血漿中花椒毒素、異茴芹內(nèi)酯、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素、蛇床子素和異歐前胡素等6種

8、香豆素類化合物含量的UPLC-ESI-MS/MS方法，成功的應用于大鼠灌胃給予蛇床子提取物后血漿中6種成分的藥代動力學研究，并建立其藥-時曲線，闡明藥動學參數(shù)與特征。
　　方法:大鼠灌胃給與蛇床子提取物(6 mL/kg)后，分別于給藥后0.08，0.17,0.33,0.5,0.75,1,1.5,2,3,4,6,9,12,18,24和30 h眼內(nèi)眥靜脈叢取血0.3 mL，制備血漿樣品，采用甲醇直接沉淀蛋白法進行樣品預處理，磺胺甲噁唑

9、為內(nèi)標。
　　結(jié)果:大鼠口服灌胃給予蛇床子提取物后，血漿中花椒毒素、異茴芹內(nèi)酯、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素、蛇床子素和異歐前胡素等6種待測成分在大鼠體內(nèi)的藥代動力學藥-時曲線有所差異，其中，歐前胡素吸收最快，達峰時間為給藥后1 h;異歐前胡素在給藥后1.5 h達到最高血藥濃度;花椒毒素達峰時間為給藥后2h左右;異茴芹內(nèi)酯和佛手柑內(nèi)酯吸收稍慢，達峰時間為給藥后3 h;蛇床子素吸收最慢，于給藥后6h達到血漿峰濃度。總體來說，大鼠灌胃給予蛇床

10、子提取物后，6種待測成分在體內(nèi)吸收均較迅速，5 min均可檢測到，并且具有相近的消除速率。
　　結(jié)論:本研究建立了UPLC-ESI-MS/MS法同時測定大鼠血漿中花椒毒素、異茴芹內(nèi)酯、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素、蛇床子素和異歐前胡素的含量，并應用于蛇床子中6種活性成分在大鼠體內(nèi)的藥代動力學研究。該方法操作簡單、快速、專屬性強、靈敏度高，對蛇床子藥材的體內(nèi)定量分析具有重要意義，有益于傳統(tǒng)中藥蛇床子的臨床應用。
　　第三部分 UPLC

11、-ESI-MS/MS法測定八子補腎膠囊中14種成分含量
　　目的:建立UPLC-ESI-MS/MS法測定八子補腎膠囊中花椒毒素、異茴芹內(nèi)酯、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素、蛇床子素、異歐前胡素、五味子甲素、五味子醇甲、金絲桃苷、槲皮苷、木犀草素、山奈酚、異鼠李素和熊果酸等14種成分的含量。
　　方法:取八子補腎膠囊20粒，傾出內(nèi)容物，研細，混勻，取粉末約4.00 g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入70％乙醇80 mL，精密稱定，超聲(

12、功率:100W;頻率:25kHz)處理60 min，放冷，再精密稱定，用70％乙醇補充損失的重量，搖勻，離心，用0.2μm濾膜濾過，續(xù)濾液作為供試品溶液，負離子模式直接進樣2μL，正離子模式稀釋40倍后進樣2μL。
　　結(jié)果:在5min內(nèi)八子補腎膠囊中14種主要成分實現(xiàn)良好分離，峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系（r2≥0.9989）;花椒毒素、異茴芹內(nèi)酯、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素、蛇床子素、異歐前胡素、五味子甲素、五味子醇甲、金絲桃苷、槲

13、皮苷、木犀草素、山奈酚、異鼠李素和熊果酸加樣回收率分別為99.56％,99.47％,99.69％,101.2％,99.89％,100.2％,99.86％,101.2％,98.69％，101.1％，98.65％，99.75％，101.9％和97.89％(n=3)。RSD值分別為1.1％,0.9％,1.3％,1.1％,1.5％,1.4％,1.4％,0.8％,1.7％,1.7％,1.9％,1.5％,1.6％和2.1％。
　　結(jié)論:該方法

14、操作簡便、準確、靈敏度高、重現(xiàn)性好，專屬性強，可用于八子補腎膠囊的質(zhì)量控制。
　　第四部分 GC-MS-SIM法同時測定蛇床子中7種香豆素類活性成分的含量
　　目的:建立一種快速、準確的GC-MS-SIM定量分析方法，同時分離、測定不同來源的蛇床子藥材中異補骨脂素、花椒毒素、佛手柑內(nèi)酯、蛇床子素、異茴芹內(nèi)酯、歐前胡素和二氫歐山芹醇等7種香豆素類活性成分的含量，并應用于12批不同來源蛇床子藥材的質(zhì)量分析。
　　方法:控制

15、色譜柱參數(shù)分析樣品。
　　結(jié)果:7種香豆素類活性成分的線性關(guān)系良好（r2≥0.9986），檢測限和定量限分別為1.06～10.11 ng/mL和3.21～29.88 ng/mL。日內(nèi)日間精密度分別為0.7～2.5％和1.2～3.3％。穩(wěn)定性和重復性的相對標準偏差分別為0.5～2.5％和0.8～3.0％。平均回收率范圍為92.38％～100.53％。
　　結(jié)論:本研究首次建立了GC-MS-SIM法，同時定性和定量分析蛇床子藥材

16、中7種香豆素類有效成分，并將該方法應用于12批不同來源藥材的質(zhì)量分析，該方法簡便、快速、靈敏度高、專屬性好，可為蛇床子藥材的質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。從樣品的含量測定結(jié)果來看，各產(chǎn)地之間12批次蛇床子藥材的質(zhì)量差異大，提示藥材質(zhì)量受產(chǎn)地及其種植地天氣狀況等的影響。因而有必要對藥材的產(chǎn)地及采集等進行跟蹤檢測，以保證蛇床子藥材質(zhì)量和藥效的穩(wěn)定。
　　第五部分 UPLC-Q-TOF-MS/MS法分析佛手柑內(nèi)酯在大鼠體內(nèi)的代謝產(chǎn)物
　　

17、目的:建立一種UPLC-Q-TOF-MS/MS分析方法，對大鼠灌胃給予佛手柑內(nèi)酯后尿液和膽汁樣品中的代謝產(chǎn)物進行鑒定研究，推測佛手柑內(nèi)酯在體內(nèi)的代謝規(guī)律和主要代謝途徑。
　　方法:大鼠灌胃給予佛手柑內(nèi)酯，收集給藥前后的尿液和膽汁，采用Waters Ostro96孔板法處理樣品。
　　結(jié)果:尿液和膽汁中共發(fā)現(xiàn)佛手柑內(nèi)酯大鼠體內(nèi)可能的代謝產(chǎn)物17個，其中尿液中有17個，膽汁中有16個，膽汁中的16個代謝產(chǎn)物在尿液中均被發(fā)現(xiàn)。佛手

18、柑內(nèi)酯在膽汁和尿液中的Ⅰ相代謝產(chǎn)物有6個，主要為雙鍵氧化，氧化脫甲基，水解等;Ⅱ相代謝產(chǎn)物有11個，主要是葡萄糖醛酸化和硫酸酯化。佛手柑內(nèi)酯在尿液和膽汁中的代謝物種類并無明顯差異，只是代謝物的含量不同。
　　結(jié)論:本研究首次建立了UPLC-Q-TOF-MS/MS法，對大鼠灌胃給予佛手柑內(nèi)酯后尿液和膽汁樣品中的代謝產(chǎn)物進行鑒定研究，推測出佛手柑內(nèi)酯在體內(nèi)的代謝規(guī)律和主要代謝途徑。該方法簡便、快速、靈敏度高、專屬性好，可用于體內(nèi)微量成