大曲華根霉(Rhizopus chinensis)固態(tài)發(fā)酵表達(dá)酯合成脂肪酶的研究.pdf

1、華根霉(Rhizopus chinensis CCTCC M201021)是從白酒大曲中分離得到的一株絲狀真菌，其在固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中能夠合成多種酯合成脂肪酶。為研究華根霉固體發(fā)酵產(chǎn)酯合成脂肪酶的特點(diǎn)和形成機(jī)理，本論文開(kāi)展了系統(tǒng)的研究。通過(guò)優(yōu)化華根霉固態(tài)發(fā)酵的培養(yǎng)條件和參數(shù)，大量制備菌體結(jié)合酯合成脂肪酶，然后對(duì)這些脂肪酶蛋白進(jìn)行分離純化和酶學(xué)性質(zhì)研究，并在蛋白質(zhì)分子水平上與液體培養(yǎng)條件下的脂肪酶進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)和確認(rèn)了固態(tài)發(fā)酵所特有的酯合成脂

2、肪酶，并詳細(xì)分析固態(tài)發(fā)酵特殊的環(huán)境條件對(duì)特征性脂肪酶產(chǎn)生的影響，揭示了誘導(dǎo)特征性酯合成脂肪酶表達(dá)的關(guān)鍵兇素。具體結(jié)果如下：
　　 (1)華根霉固體發(fā)酵產(chǎn)全細(xì)胞酯合成脂肪酶的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件優(yōu)化
　　 為進(jìn)一步提高華根霉菌體結(jié)合脂肪酶的生產(chǎn)水平，獲得一定數(shù)量的目的酶用于后續(xù)研究，對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基各主要成分含量和發(fā)酵條件進(jìn)行了單因素考察和優(yōu)化。以脂肪酶合成活性為指標(biāo)，得到的培養(yǎng)基組成為(w/w)：小麥18%，麩皮12%，乳糖2%

3、(補(bǔ)充碳源)，蛋白胨2%(補(bǔ)充氮源)，橄欖油2%(v/w，誘導(dǎo)物)，K2HPO40.3%，MgSO4·7H2O0.07%；最佳產(chǎn)酶條件為：起始水分含量70%，接種量106孢子/g干基，培養(yǎng)溫度30℃，初始pH值6.5，培養(yǎng)時(shí)間72 h。優(yōu)化后的培養(yǎng)基將菌體結(jié)合酯合成脂肪酶的活力提高至24432 U/kg干基，為優(yōu)化前培養(yǎng)基酶活的4.1倍。
　　 (2)華根霉固態(tài)發(fā)酵酯合成脂肪酶的分離純化
　　 為在蛋白質(zhì)水平上研究固態(tài)發(fā)

4、酵表達(dá)的酯合成脂肪酶，需要對(duì)其進(jìn)行分離純化。將R.chinensis固體發(fā)酵的細(xì)胞破碎后，利用Triton X-100提取胞膜粗蛋白，然后經(jīng)過(guò)硫酸銨沉淀、丁基疏水層析和Superdex75凝膠過(guò)濾層析得到兩個(gè)酯合成脂肪酶同工酶，分別命名為SSL1和SSL2。SSL1的分子量約為64 kDa，SS L2的分子量是33 kDa。利用相同的步驟純化R.chinensis液態(tài)發(fā)酵的酯合成脂肪酶，也得到了兩個(gè)脂肪酶同工酶，分別是SML1和SML2

5、。通過(guò)N端序列和肽質(zhì)量指紋圖譜比對(duì)，發(fā)現(xiàn)SSL2是固體發(fā)酵和液體發(fā)酵的共有蛋白質(zhì)，而SSL1則可能是與固體發(fā)酵相偶聯(lián)的特征性脂肪酶，而且SSL1與已報(bào)道的根霉脂肪酶的同源性很低，應(yīng)該是一種新型的脂肪酶。
　　 (3)固態(tài)發(fā)酵特征性酯合成脂肪酶(SSL1)的生化性質(zhì)研究
　　 以水解活性為表征，對(duì)純化的固態(tài)發(fā)酵特征性酯合成脂肪酶(SSL1)的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，結(jié)果表明，SSL1水解活性的最適反應(yīng)溫度是40℃，其在50℃以下

6、保留1h仍然能維持原始活性的80%以上；最適反應(yīng)pH為8.0，在pH6.5～8.0的條件下也比較穩(wěn)定。K+顯著提高了SSL1的水解活性，而Cu2+和Hg2+則完全抑制了其活性。純化的SSL1對(duì)三氯甲烷、正己烷等有機(jī)溶劑有較好的耐受性。底物特異性研究表明，該脂肪酶對(duì)中長(zhǎng)鏈的脂肪酸酯具有較高的水解活性，對(duì)硝基苯酚棕櫚酸酯(C16)是其最適底物。以合成活性為表征，純化的SSL1最適pH記憶是7.5，最適反應(yīng)溫度是30℃。在有機(jī)相中催化合成脂肪

7、酸乙酯的研究表明，以乙醇為?；荏w時(shí)，SSL1的最佳酰基供體足肉豆蔻酸，而且對(duì)于碳鏈長(zhǎng)度大于8的中長(zhǎng)鏈脂肪酸，該脂肪酶也表現(xiàn)出較高的酯合成的能力。
　　 將SSL1與液態(tài)發(fā)酵特殊的酯合成脂肪酶(SML1)進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)SSL1在熱穩(wěn)定性及有機(jī)溶劑耐受性等方面顯著優(yōu)于SML1。另外，兩者在金屬離子的影響、水解底物特異性、pH記憶以及合成反應(yīng)的最佳?；w等酶學(xué)特性和催化特性上也存在一定差異。
　　 (4)抗SSL1兔多克隆

8、抗體的制備以及SSL1特征性的驗(yàn)證
　　 為了驗(yàn)證SSL1是固體發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的特征性酯合成脂肪酶，利用純化的SSL1為抗原免疫新西蘭大白兔制備抗SSL1多克隆抗體，經(jīng)4次免疫后，血清效價(jià)達(dá)1：10000。多克隆抗體經(jīng)Protein A親和柱層析后，純度完全符合檢測(cè)要求。利用免疫印跡分析固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵的蛋白表達(dá)情況，結(jié)果表明，多克隆抗體能夠與固體發(fā)酵的胞內(nèi)和胞膜粗蛋自發(fā)生特異性反應(yīng)，證明SSL1存在于固體發(fā)酵的細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞膜

9、上；但是抗SSL1多克隆抗體不能與液體發(fā)酵的任何組分(細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞外和細(xì)胞膜)發(fā)生特異性反應(yīng)，說(shuō)明SSL1在液體發(fā)酵過(guò)程中沒(méi)有表達(dá)。
　　 (5)固態(tài)發(fā)酵非特征性酯合成脂肪酶(SSL2)的生化性質(zhì)研究
　　 以水解活性為表征，對(duì)純化的固態(tài)發(fā)酵非特征性酯合成脂肪酶(SSL2)的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，結(jié)果表明，SSL2水解活性的最適反應(yīng)溫度是40℃，在35℃以下較為穩(wěn)定；最適反應(yīng)pH為8.5，在pH5.5～7.0的環(huán)境中也較為穩(wěn)

10、定。Mn2+顯著提高了該脂肪酶的水解活性，而Cu2+，Zn2+，F(xiàn)e2+，Hg2+和Fe3+則強(qiáng)烈抑制了這一活性。純化的SSL2對(duì)甲醇、乙醇、正己烷和異辛烷等有機(jī)溶劑有較好的耐受性，而其他溶劑使脂肪酶失活嚴(yán)重。底物特異性研究表明，SSL2對(duì)對(duì)硝基苯酚月桂酸酯(C12)的脂肪酸鏈長(zhǎng)特異性最高，對(duì)中長(zhǎng)鏈的脂肪酸酯也具有較高的水解活性。以合成活性為表征，純化的SSL2的最適pH記憶和反應(yīng)溫度分別是6.0和30℃；在有機(jī)相中催化合成反應(yīng)的脂肪酸

11、和脂肪醇的底物特異性研究表明，該酶的最適底物脂肪酸是正辛酸，最適底物脂肪醇是正丁醇。
　　 將SSL2與液態(tài)發(fā)酵非特征性酯合成脂肪酶SML2進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)兩者的酶學(xué)特性和催化特性基本相同，但是SSL2比SML2最適反應(yīng)溫度更高。另外，兩者在金屬離子的影響、有機(jī)溶劑耐受性等酶學(xué)特性上也存在些許差異。
　　 (6)誘導(dǎo)SSL1表達(dá)的固態(tài)發(fā)酵關(guān)鍵因素的考察
　　 結(jié)合Western blotting和間接Elisa法研

12、究固態(tài)發(fā)酵特殊的環(huán)境因素對(duì)SSL1的誘導(dǎo)作用，發(fā)現(xiàn)界面的存在和較高的培養(yǎng)溫度皆不是誘導(dǎo)SSL1產(chǎn)生的關(guān)鍵參數(shù)。在平板培養(yǎng)和標(biāo)準(zhǔn)固態(tài)發(fā)酵中的各層菌絲體中，SSL1都在營(yíng)養(yǎng)菌絲體中高量表達(dá)，而氣生菌體以及菌膜都不利于產(chǎn)SSL1，所以氣生菌絲體的存在可能與SSL1的表達(dá)沒(méi)有直接聯(lián)系。低水活度是誘導(dǎo)SSL1產(chǎn)生的一個(gè)關(guān)鍵因素，降低培養(yǎng)基的水活度能夠誘導(dǎo)SSL1生成，并且與調(diào)節(jié)水活度的化合物無(wú)關(guān)；而且在發(fā)酵后培養(yǎng)的過(guò)程中，降低水活度仍然可以提高S