基因工程菊粉內(nèi)切酶畢赤酵母表達(dá)優(yōu)化與菊寡糖制備研究.pdf

1、菊糖是一種天然的果聚糖,是植物體內(nèi)的一種儲(chǔ)藏性碳水化合物.國(guó)內(nèi)外關(guān)于微生物菊粉內(nèi)切酶酶學(xué)性質(zhì)、基因結(jié)構(gòu)、工程菌株構(gòu)建與生產(chǎn)應(yīng)用方面的研究進(jìn)展迅速,王建華小組已成功構(gòu)建兩株能高效表達(dá)菊粉內(nèi)切酶的基因工程酵母,該實(shí)驗(yàn)利用其中一株基因工程酵母—畢赤嗜甲醇酵母(Pichia methanolica)進(jìn)行高密度培養(yǎng)表達(dá)黑曲霉菊粉內(nèi)切酶,并對(duì)用于指導(dǎo)生產(chǎn)實(shí)踐的酶的一些特性進(jìn)行了研究,利用菊苣為原料,采用現(xiàn)代生物技術(shù)和分析技術(shù),對(duì)菊粉的提取和菊粉寡糖

2、的生產(chǎn)進(jìn)行了較深入細(xì)致的研究,這對(duì)菊粉寡糖的工業(yè)化生產(chǎn)具有一定的指導(dǎo)意義.主要結(jié)果如下:1 菊粉內(nèi)切酶基因的表達(dá) 1.1 搖瓶培養(yǎng):通過不同碳源、不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基、微量元素的濃度、菌體密度、pH值、甲醇濃度、甲醇誘導(dǎo)周期對(duì)酶蛋白表達(dá)的影響研究,對(duì)高密度培養(yǎng)的培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化.1.2 高密度培養(yǎng):采用三種培養(yǎng)基F<,1>、F<,2>、和F<,3>進(jìn)行試驗(yàn),分別測(cè)定酵母的生長(zhǎng)曲線,都符合指數(shù)生長(zhǎng)曲線,細(xì)胞生長(zhǎng)延遲期分別為1.36h,2.29h

3、,2.48h,比生長(zhǎng)速率μ分別為0.4846h<'-1>,0.2856h<'-1>,0.2813h<'-1>.采用F<,1>培養(yǎng)基時(shí),其優(yōu)點(diǎn)是不產(chǎn)生沉淀,酵母生長(zhǎng)速度快,培養(yǎng)周期短.2 酶的特性研究表明,酶作用的最適溫度為55℃,高于60℃時(shí)開始失活;其最佳pH為5.5,在pH4.5到pH6.5時(shí)較為穩(wěn)定;Hg<'2+>、Pb<'2+>、Ba<'2+>對(duì)酶活具有顯著抑制作用;Ca<'2+>能顯著提高酶活,Mg<'2+>、Fe<'3+>、

4、Cu<'2+>、Zn<'2+>對(duì)酶活作用不明顯;EDTA對(duì)酶活具有部分抑制作用.酶底物研究表明,酶水解菊粉,但不水解棉子糖,水解蔗糖活性較低.3 在菊粉提取試驗(yàn)中,采用干菊苣粉用循環(huán)方式進(jìn)行水抽提,在料液比為1:15,溫度為80℃,浸提時(shí)間為2h時(shí)提取率達(dá)98﹪.4 在酶解試驗(yàn)中,菊粉濃度為200g/L(即接觸最大溶解度)時(shí),反應(yīng)30h,菊粉寡糖最大產(chǎn)率為62.0﹪,菊粉寡糖的最大產(chǎn)率與酶的用量無關(guān),但隨著酶濃度的提高,菊粉寡糖達(dá)到最大