還原性糖鏈的靶板衍生化MALDI-TOF-MS分析方法建立及應(yīng)用研究.pdf

1、糖類物質(zhì)有著重要的生物學(xué)功能，如參與細(xì)胞識(shí)別、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及與受體的相互作用等。質(zhì)譜(MS)已在生物大分子的分析檢測(cè)中得到廣泛應(yīng)用。但是由于生物來(lái)源糖鏈結(jié)構(gòu)高度復(fù)雜、表達(dá)具有微觀不均一性，具有多羥基，有的含唾液酸，極性大，影響其在MS分析時(shí)的離子化效率和檢測(cè)靈敏度。通過(guò)化學(xué)衍生法改善糖鏈?zhǔn)杷曰螂婋x特性，可提高樣品在MS檢測(cè)分析中的離子化效率和分析靈敏度。但現(xiàn)有衍生化反應(yīng)一般需要多個(gè)步驟和處理過(guò)程（唾液酸易丟失），樣品用量較大，需純化富集才

2、能進(jìn)行MS分析，不利于微量生物來(lái)源寡糖鏈的分析和檢測(cè)。因而，已有研究利用MALDI-TOF-MS分析樣品時(shí)基質(zhì)（含三氟乙酸）作催化劑，在靶板上對(duì)還原性糖鏈與氨基類試劑在室溫條件下進(jìn)行標(biāo)記，待靶板干燥，即可直接進(jìn)行后續(xù)MALDI-TOF-MS分析。但是，該類方法存在衍生化效率低、唾液酸易丟失等缺陷?；诖?，本研究選用肼基衍生化試劑，在生理?xiàng)l件下與還原性糖鏈進(jìn)行標(biāo)記，擬建立還原性糖鏈靶板直接衍生化用于提高M(jìn)ALDI-TOF-MS靈敏度的分析

3、方法，解決現(xiàn)有靶板衍生化效率低，唾液酸易丟失的缺陷。結(jié)果如下:
　　(1)以乳糖為標(biāo)準(zhǔn)，優(yōu)化了吉拉德T(Girard's T，GT)靶板衍生化條件。建立了靶板直接衍生化用于提高還原性糖MALDI-TOF-MS靈敏度分析的方法。以Maltodextrin為標(biāo)準(zhǔn)糖鏈，經(jīng)GT衍生化后，MALDI-TOF-MS檢測(cè)衍生化效率為95％。對(duì)方法的線性范圍、檢測(cè)限、重復(fù)性和穩(wěn)定性進(jìn)行了評(píng)估。結(jié)果表明:在128倍濃度范圍內(nèi)（0.78nmol/mL

4、-10.00μmol/mL）方法穩(wěn)定(R2=0.9992);重復(fù)性良好(RSD=3.06％);在10天之內(nèi)，檢測(cè)穩(wěn)定性良好(RSD=2.95％)，最低檢測(cè)限為0.15ng。采用內(nèi)標(biāo)法定量，結(jié)果顯示乳糖、來(lái)源于Ovalbumin和RNase B的N-糖鏈衍生化后質(zhì)譜檢測(cè)靈敏度分別提高了22.92、10.20和9.17倍。將方法應(yīng)用于羊乳總蛋白N-糖鏈和人乳游離寡糖鏈靶板衍生化分析。結(jié)果顯示，衍生化后可以同時(shí)檢測(cè)中性糖和唾液酸化糖鏈，未發(fā)現(xiàn)

5、唾液酸丟失現(xiàn)象;并且可以檢測(cè)出低豐度糖鏈（未衍生化時(shí)檢測(cè)不到），提高了質(zhì)譜分析靈敏度。
　　(2)本研究選用不同電荷性質(zhì)的8種肼基試劑（吉拉德P、吉拉德T、苯肼、苯磺酰肼、苯甲酰肼、氨基硫脲、4-苯基-3-氨基硫脲、4-肼基苯甲酸），對(duì)還原性糖鏈靶板衍生化效率和后續(xù)質(zhì)譜效果進(jìn)行比較分析。以Maltodextrin和胎牛血清N-糖鏈為標(biāo)準(zhǔn)糖鏈進(jìn)行衍生化效率對(duì)比。結(jié)果表明:在等摩爾量衍生化試劑條件下，對(duì)于中性糖Maltodextrin

6、靶板衍生化后，試劑的靶板衍生化效率由高到低依次為:GP=GT＞PNH＞BZH=TSC＞PTSC=HBA＞BSH;對(duì)于唾液酸化N-糖鏈（胎牛血清）靶板衍生化后，試劑的衍生化效率由高到低依次為GP＞GT＞PNH＞BSH＞PTSC＞HBA＞BZH＞TSC。結(jié)果表明，GP適宜于中性和酸性糖的靶板衍生化，且不引起唾液酸丟失。胎牛血清N-糖鏈經(jīng)GP衍生化后檢測(cè)靈敏度提高了14.00倍，最低檢測(cè)限為75.00 pg。該方法已成功應(yīng)用于微量樣品（大豆總