新型DNA-納米粒子生物功能化探針在DNA和細(xì)胞檢測(cè)中的應(yīng)用.pdf

1、生物傳感對(duì)于研究生物體內(nèi)分子及細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能、生命活動(dòng)的規(guī)律和本質(zhì)、疾病的診斷、抗癌抗衰老等藥物的設(shè)計(jì)、環(huán)境監(jiān)測(cè)等都具有十分重要的意義。本文將DNA識(shí)別元件、適體識(shí)別元件與性能優(yōu)良的納米材料相結(jié)合，設(shè)計(jì)和研究了幾種新型生物功能化探針，可用于癌細(xì)胞和靶DNA的特異性識(shí)別及檢測(cè)。主要包括：
　　 1.設(shè)計(jì)了一種細(xì)胞外超分子網(wǎng)狀DNA/量子點(diǎn)(QD)鞘膜探針，可用于癌細(xì)胞的高亮度的熒光成像。該超分子網(wǎng)狀DNA/QD鞘膜是由修飾了Ra

2、mos細(xì)胞適體的DNA納米線作為骨架，層層自組裝大量的DNA/CdTe QD探針構(gòu)建而成。其中，DNA納米線骨架上負(fù)載的Ramos細(xì)胞適體可以特異性識(shí)別Ramos細(xì)胞并纏繞到細(xì)胞表面，同時(shí)，DNA納米線骨架與DNA/CdTe QD探針發(fā)生多層自組裝，形成超分子網(wǎng)狀DNA/CdTe QD鞘膜，將細(xì)胞牢牢包裹于其中。由于該超分子網(wǎng)狀DNA/QD鞘膜攜帶大量的熒光量子點(diǎn)，具有極高的熒光強(qiáng)度，是一種的生物相容性良好的熒光成像材料。對(duì)構(gòu)建的DNA

3、納米線和超分子網(wǎng)狀DNA/QD鞘膜進(jìn)行了結(jié)構(gòu)表征，并將該材料用于Ramos細(xì)胞的熒光成像，獲得了高熒光亮度的細(xì)胞成像圖。該材料也成功的應(yīng)用于混合細(xì)胞系中Ramos細(xì)胞的識(shí)別，進(jìn)一步證明了它良好的選擇性。
　　 2.構(gòu)建了一種新型的基于超分子網(wǎng)狀DNA/CdTe QD鞘膜探針的電化學(xué)細(xì)胞傳感器，可用于癌細(xì)胞的高靈敏高選擇性定量檢測(cè)。以Ramos細(xì)胞作為靶細(xì)胞，考察了方法的可行性。該電化學(xué)細(xì)胞傳感器的構(gòu)建原理為：將一端生物素修飾的R

4、amos適體固定到親和素標(biāo)記的聚苯乙烯微孔板上，由于適體對(duì)Ramos細(xì)胞具有很強(qiáng)的特異性識(shí)別能力，當(dāng)加入細(xì)胞樣品后，Ramos細(xì)胞被適體牢牢的固定在微孔板底部，再加入超分子網(wǎng)狀DNA/CdTe QD鞘膜探針的合成原料，在細(xì)胞表面形成致密的超分子鞘膜探針。由于該超分子鞘膜是由DNA與CdTe QD發(fā)生多層自組裝而成，負(fù)載了大量的CdTe QD標(biāo)記物，具有顯著的信號(hào)放大作用。將膜上的CdTe QD用稀酸溶解后得到Cd2+溶液，利用靈敏的差分

5、脈沖陽(yáng)極溶出伏安法(DPASV)對(duì)Cd2+進(jìn)行定量檢測(cè)。在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，該電化學(xué)細(xì)胞生物傳感器檢測(cè)Ramos細(xì)胞的線性范圍是10到1000個(gè)細(xì)胞，檢測(cè)限為10個(gè)細(xì)胞。另外，該方法也成功的用于混合細(xì)胞系中Ramos細(xì)胞的檢測(cè)，證明該方法不僅靈敏度高，還具有良好的選擇性，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。
　　 3.研制了一種新穎的信號(hào)放大型熒光探針，可用于癌細(xì)胞的高亮度熒光成像以及靶DNA的可視化檢測(cè)。該探針以表面羧基化的聚苯乙烯微球?yàn)檩d體

6、，共價(jià)結(jié)合DNA連接鏈，并以該連接鏈為起始端，自組裝DNA納米線/CdTe QD探針構(gòu)建而成。由于DNA納米線末端包含靶分子的識(shí)別序列，可特異性的與靶分子結(jié)合，確保探針的良好選擇性；DNA納米線中間部分含有大量的CdTe QD探針結(jié)合序列，可負(fù)載大量的熒光標(biāo)記物，因此可產(chǎn)生顯著的信號(hào)放大效應(yīng)。本工作分別以細(xì)胞適體和靶DNA的互補(bǔ)序列為識(shí)別元件，構(gòu)建了可用于癌細(xì)胞的高亮度熒光成像的功能化探針和靶DNA的可視化檢測(cè)的探針。在癌細(xì)胞的熒光成像

7、中_，該探針表現(xiàn)出了良好的特異性和熒光成像能力；在DNA的可視化檢測(cè)中，利用這種探針可以直接觀測(cè)到50 fM的靶DNA雜交反應(yīng)。
　　 4.研制了一種新型一對(duì)一識(shí)別型三聯(lián)金納米粒子DNA探針，并構(gòu)建了高靈敏的電化學(xué)DNA生物傳感器。其工作原理為：在金電極表面固定巰基修飾的捕獲DNA，之后分別與靶DNA和三聯(lián)金納米粒子DNA探針雜交，形成“三明治”式的DNA雜交復(fù)合物。探針上的三個(gè)金納米粒子修飾了大量信號(hào)DNA，可以吸附大量的電化

8、學(xué)指示劑[Ru(NH3)6]3+，利用計(jì)時(shí)電量法可實(shí)現(xiàn)靶DNA的電化學(xué)檢測(cè)。該方法具有以下優(yōu)點(diǎn)：一個(gè)三聯(lián)金納米粒子DNA探針只有一條靶DNA的識(shí)別鏈，因此可實(shí)現(xiàn)一對(duì)一的靶DNA識(shí)別和雜交，避免了傳統(tǒng)DNA探針對(duì)靶DNA的消耗，提高了方法的靈敏度和選擇性；三個(gè)金納米粒子具有顯著的信號(hào)放大效應(yīng)，進(jìn)一步提高了靈敏度。在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，檢測(cè)靶DNA的線性范圍是1×10-16 M～1×10-14 M，檢測(cè)限為53 aM(3σ)。此外，對(duì)兩堿基錯(cuò)