粗糙脈孢菌ncw1基因功能研究.pdf

1、生物質(zhì)降解轉(zhuǎn)化的核心之一是如何將復(fù)雜的木質(zhì)纖維素降解為可發(fā)酵糖。當前實現(xiàn)這一降解的技術(shù)瓶頸是纖維素酶的成本過高。圍繞著如何降低纖維素酶的生產(chǎn)成本，有必要對重要的模式真菌粗糙脈孢菌（Neurospora crassa）降解利用纖維素的機理進行解析以及對纖維素酶高產(chǎn)菌里氏木霉（Trichoderma reesei）RL-P37進行遺傳改造。
　　作為重要的模式真菌，粗糙脈孢菌（Neurospora crassa）可以很方便地用于纖維素

2、酶的機理研究。Δncw1(NCU05137)突變體纖維素酶的表達和分泌顯著提升，本研究利用分子生物學和系統(tǒng)生物學方法探索了其高產(chǎn)纖維素酶的機理。首先通過搖瓶發(fā)酵和RT-qPCR確認了該突變體能夠提高纖維素酶的表型。生長實驗發(fā)現(xiàn)其對溫度、剛果紅的敏感性與野生型一致，誘導(dǎo)實驗發(fā)現(xiàn)其孢子生長產(chǎn)酶和菌絲產(chǎn)酶具有一致性。掃描電鏡發(fā)現(xiàn)缺失ncw1能夠引起細胞壁的變化。通過回補和過表達發(fā)現(xiàn)NCW1定位于成熟菌絲的隔膜，其過表達菌株與野生型表型相近。與

3、Δcre1的雜交獲得了纖維素酶進一步提高的雙突變體，表明NCW1并不直接影響碳代謝阻遏效應(yīng);與Δ3βG雜交獲得了纖維二糖利用加快及纖維素酶誘導(dǎo)表達顯著提升的四突變體S22，說明NCW1與纖維二糖轉(zhuǎn)運及誘導(dǎo)纖維素酶表達途徑相關(guān)。以上結(jié)果初步闡明了ncw1在纖維素酶表達分泌過程中的作用。
　　作為纖維素酶高產(chǎn)菌株，里氏木霉(Trichoderma reesei)RL-P37被廣泛地應(yīng)用在工業(yè)蛋白的生產(chǎn)過程。從基因水平對工業(yè)菌株進行分子

4、改造已經(jīng)成為提升工業(yè)菌株生產(chǎn)性狀的重要手段。因此，亟需構(gòu)建適用于靶向基因研究及外源蛋白表達的營養(yǎng)缺陷型菌株，特別是可用于基因無痕敲除的尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株。本研究以潮霉素抗性基因為標記，成功構(gòu)建了里氏木霉RL-P37尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株，并得到southern驗證。該菌株在含有1.5mg/mL5-氟乳清酸、2mg/mL尿苷的MM培養(yǎng)基中可以正常生長，并且在不含有尿苷的MM培養(yǎng)基上不能生長。此外，利用粗糙脈孢菌(Neurosporacra