泌鹽植物中華補(bǔ)血草SOS1基因的克隆及其功能研究.pdf

1、鹽脅迫是嚴(yán)重影響植物生長發(fā)育的非生物因素之一。土壤鹽漬化會(huì)引起大多數(shù)植物體內(nèi)Na+過量積累,進(jìn)而影響植物的生長。鹽生植物能在鹽漬環(huán)境下正常生長,因此,克隆鹽生植物的耐鹽性關(guān)鍵基因并研究其功能,有助于深入理解植物的耐鹽機(jī)制,利用相關(guān)的基因資源,培育轉(zhuǎn)基因耐鹽植物,有效地改善和利用鹽漬化土地。
　　本實(shí)驗(yàn)以泌鹽鹽生植物中華補(bǔ)血草(Limonium sinense Kuntze)為材料,首先研究了補(bǔ)血草幼苗在不同鹽濃度下的脅迫響應(yīng)、SO

2、S1基因的表達(dá)變化及中華補(bǔ)血草葉片中抗氧化酶的活性變化;其次,克隆了中華補(bǔ)血草SOS1基因(LsSOS1),構(gòu)建了過量表達(dá)載體、融合基因表達(dá)載體及沉默干擾表達(dá)載體,在擬南芥中將LsSOS1基因進(jìn)行了過量表達(dá)和 LsSOS1-GFP融合基因的表達(dá)并在中華補(bǔ)血草中做了 LsSOS1RNAi遺傳轉(zhuǎn)化。對(duì)獲得的純合轉(zhuǎn)基因擬南芥及LsSOS1沉默轉(zhuǎn)基因中華補(bǔ)血草進(jìn)行分子鑒定、耐鹽性分析、LsSOS1表達(dá)產(chǎn)物定位觀察及LsSOS1基因的表達(dá)變化研究

3、。進(jìn)一步了解LsSOS1基因在鹽生植物中華補(bǔ)血草耐鹽過程中的重要作用。
　　實(shí)驗(yàn)主要結(jié)果如下:
　　(1)中華補(bǔ)血草幼苗在不同鹽濃度下的脅迫響應(yīng)及LsSOS1基因的表達(dá)變化
　　彎根實(shí)驗(yàn)中,低鹽濃度下補(bǔ)血草根的生長情況好于對(duì)照,隨著鹽濃度的升高,根的生長逐漸受到抑制。NaCl濃度高于200mmol/L時(shí),中華補(bǔ)血草受到鹽脅迫, LsSOS1基因的表達(dá)量升高,根部高于葉片。
　　(2)鹽脅迫下中華補(bǔ)血草葉片中抗氧化

4、酶的活性變化
　　中華補(bǔ)血草在低鹽處理下,酶促活性氧自由基清除系統(tǒng)的各種酶活性與對(duì)照相比沒有明顯變化。但是,隨著NaCl濃度的增加,中華補(bǔ)血草受到鹽脅迫,活性氧清除酶類(SOD、POD、APX、CAT)的酶活性上升。說明在一定的濃度范圍內(nèi),補(bǔ)血草可以通過調(diào)節(jié)自身的抗氧化酶系統(tǒng)及其獨(dú)特的泌鹽、耐鹽機(jī)制來抵御鹽脅迫帶來的損傷,維持正常的生長。
　　(3)中華補(bǔ)血草LsSOS1基因的克隆及序列分析
　　根據(jù)其他物種中保守的S

5、OS1基因序列,設(shè)計(jì)簡并引物,利用RACE的方法克隆得到LsSOS1基因序列,開放閱讀框包含3456個(gè)核苷酸,推導(dǎo)編碼的蛋白質(zhì)有1152個(gè)氨基酸殘基組成,與大葉補(bǔ)血草SOS1基因(Limonium gmelinii SOS1)的同源性最高,達(dá)到了97％,編碼一種Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。
　　(4) LsSOS1基因異源過量表達(dá)研究
　　篩選得到了10個(gè)過表達(dá)LsSOS1的轉(zhuǎn)基因擬南芥株系,選用三個(gè)純合轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行分子研究

6、和生理生化分析。通過Real-time PCR分析LsSOS1基因在擬南芥中表達(dá)量的差異。在不同濃度NaCl脅迫下,轉(zhuǎn)基因植株的萌發(fā)和生長情況要優(yōu)于野生型,轉(zhuǎn)基因植株比野生型植株的耐鹽性有所提高,轉(zhuǎn)基因植株的鮮重、干重及K+/Na+比率高于野生型,但是轉(zhuǎn)基因植株間的差異并不明顯。
　　(5) LsSOS1表達(dá)產(chǎn)物亞細(xì)胞定位分析
　　篩選得到過量表達(dá)P35S::LsSOS1-GFP的轉(zhuǎn)基因擬南芥。在共聚焦顯微鏡下通過觀察GFP

7、的綠色熒光確定LsSOS1表達(dá)產(chǎn)物的定位。初步確定了LsSOS1在細(xì)胞膜或細(xì)胞壁上表達(dá),而不是在液泡膜或細(xì)胞質(zhì)中。為了進(jìn)一步確認(rèn)是在細(xì)胞質(zhì)膜上,可以用甘露醇將細(xì)胞皺縮質(zhì)壁分離,再進(jìn)行觀察。
　　(6) LsSOS1RNAi沉默轉(zhuǎn)基因中華補(bǔ)血草耐逆性分析
　　通過優(yōu)化遺傳轉(zhuǎn)化體系,外植體的轉(zhuǎn)化率達(dá)到了20%,篩選獲得了30株 Ls SOS1RNAi沉默轉(zhuǎn)基因株系。
　　對(duì)其中的3個(gè)株系進(jìn)行 LsSOS1基因的表達(dá)研究和生