基于微流控芯片的濃度梯度實現(xiàn)新方法及其應用研究.pdf

1、生物體能夠感受周圍環(huán)境中多種化學分子信號,并根據(jù)其濃度梯度改變自身的生理活動。傳統(tǒng)的研究生物體對于外界環(huán)境反應的方法操作繁瑣、耗時較長、難以定量分析、并且不具有通用性。微流控芯片技術(shù)能夠?qū)⒉煌牟僮髡显谝粔K芯片內(nèi),從而實現(xiàn)分析設(shè)備的微型化、集成化、自動化,將可以解決傳統(tǒng)方法難以解決的生物學問題。因此,利用微流控芯片模擬外界環(huán)境,建立化學物質(zhì)濃度梯度,并在細胞以及個體水平上研究生物體對于外界環(huán)境的反應無疑具有重要的意義。
　　本文

2、建立了一種新型濃度梯度微流控芯片。不同于已報道的常見的“圣誕樹”的濃度梯度形成結(jié)構(gòu),該芯片利用階梯狀微通道網(wǎng)絡(luò),采用了逐步分流再混流的方式逐步稀釋樣品溶液,從而產(chǎn)生液體濃度梯度。
　　我們首先對該微流控芯片進行理論分析與優(yōu)化。采用數(shù)學建模的方法對這種通過液體串行稀釋而產(chǎn)生化學物質(zhì)濃度梯度的微流控新方法進行了原理闡述。通過流體力學計算方法,對微流控芯片內(nèi)微通道結(jié)構(gòu)進行了數(shù)學建模,并模擬分析不同的結(jié)構(gòu)對于濃度梯度的影響。結(jié)果表明采用微

3、通道寬度為100μm、下層主通道液體分流的分叉口處于右位、入口流量為0.5μL/min時的階梯狀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)最有利于形成液體濃度梯度。
　　為了驗證數(shù)學模擬的結(jié)果,我們在芯片入口分別通入水和熒光素,并通過熒光顯微鏡進行成像分析。結(jié)果表明在芯片內(nèi)混流的區(qū)域,水和熒光素實現(xiàn)了完全混合,并在出口的六條微通道處形成了線性濃度梯度。在出口主通道中,六路溶液呈現(xiàn)層流特性,形成了明顯的穩(wěn)定的濃度梯度,保持了較長距離。實驗結(jié)果與流體動力學計算得到的模

4、擬結(jié)果非常吻合。
　　之后,我們利用該微流控芯片進行了細胞水平上的應用。表達有可以檢測細胞凋亡的CD2探針的HeLa細胞通過正壓從芯片出口處進入主通道內(nèi),并貼附其通道壁生長。通過該芯片微通道網(wǎng)絡(luò)在主通道中形成穩(wěn)定的抗癌藥物—順鉑濃度梯度,從而實現(xiàn)不同濃度的順鉑藥物對細胞的處理。利用熒光能量共振轉(zhuǎn)移成像系統(tǒng)對順鉑誘導細胞凋亡的進行實時在體監(jiān)測。實驗表明:順鉑可以誘導HeLa細胞凋亡,且順鉑的濃度與細胞凋亡率呈正相關(guān),其中蛋白酶Cas

5、pase-2介導了順鉑誘導的細胞凋亡。這些結(jié)果說明該微流控濃度梯度產(chǎn)生芯片可以用于細胞凋亡的研究。
　　最后,我們利用該微流控芯片形成了傳統(tǒng)方法難以實現(xiàn)的含有濃度梯度的線蟲培養(yǎng)環(huán)境,并分析了線蟲對于NaCl的趨向性以及趨向?qū)W習行為。通過正壓,我們將線蟲直接注入芯片內(nèi)出口主通道中,并通過芯片內(nèi)階梯狀微通道網(wǎng)絡(luò)在主通道中形成NaCl濃度梯度。為定量分析芯片內(nèi)線蟲的化學物質(zhì)趨向性行為,我們通過成像,分析了在出口主通道中不同NaCl濃度區(qū)

6、域內(nèi)的線蟲分布。結(jié)果表明野生型線蟲主要趨向于濃度大于20mM的NaCl溶液,對于50-100mM之間的NaCl溶液沒有偏好性,對高于300mM的NaCl溶液則表現(xiàn)出明顯的厭惡性行為。此外,我們在該芯片內(nèi)直接實現(xiàn)了NaCl與饑餓共處理線蟲,從而將線蟲的學習訓練與訓練后趨向性分析同在一塊芯片內(nèi)進行。結(jié)果表明:類似于平板上的學習行為,NaCl與饑餓共處理的線蟲表現(xiàn)出厭惡原來喜歡的低濃度的NaCl的行為。這種芯片內(nèi)學習方式可以讓線蟲通過學習建立

7、低濃度NaCl與厭惡行為的聯(lián)系。因此,該芯片可以為研究線蟲的化學物質(zhì)趨向以及學習行為提供良好的研究平臺,并能夠提高分析效率,降低分析時間,可以分析記憶時間很短的線蟲可塑性學習行為。
　　上述實驗結(jié)果表明該微流控新技術(shù)平臺具有設(shè)計新穎、結(jié)構(gòu)簡單以及實現(xiàn)效果明顯的特點,能夠?qū)崿F(xiàn)可控的化學物質(zhì)濃度梯度,并能夠應用于不同的生物體系中。除了形成濃度梯度,該方法還可以形成溫度梯度,為將來研究細胞和多細胞生物體在不同溫度條件下的反應提供一種新的