幾種食源性致病菌快速檢測技術的建立.pdf

1、近年來，由于食品安全事件頻發(fā)，食品安全問題越來越成為社會關注的熱點。其中，食源性致病菌是引起食品安全問題的重要因素。金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、副溶血弧菌、志賀氏菌、單核細胞增生李斯特菌、蠟樣芽胞桿菌和溶藻弧菌是常見的食源性致病菌。目前檢測食源性致病菌手段主要采用細菌分離、培養(yǎng)、生化鑒定等方法，操作繁瑣，檢測周期長，每次只能檢出一種細菌，一般需要5～7天才能給出檢測報告，且敏感度低、特異性差。因此研究食源性致病菌快速、準確檢測方法以預防和

2、控制食品安全事件的發(fā)生，具有重要的現實意義。
　　 近年來，隨著食源性致病菌的全基因序列的測定與分析，以及大量毒株部分基因序列的獲得，越來越多的分子生物學技術以其快速、靈敏等優(yōu)勢得到了廣泛的應用。本文根據以上提到的幾種常見的食源性致病菌的保守毒力基因序列，分別建立了副溶血弧菌tdh基因的LAMP檢測方法，五種食源性致病菌多重PCR檢測方法，七種食源性致病菌基因芯片檢測方法，為食源性疾病的快速診斷和預警監(jiān)測體系的建立提供了重要的技

3、術保障。
　　 環(huán)等溫核酸擴增技術是一種在等溫條件下高特異性、高效、快速地擴增靶基因的DNA擴增技術。應用在線軟件Primer ExplorerV4.0，針對副溶血弧菌特異性的毒力基因tdh基因設計LAMP引物。對反應溫度和反應時間等參數進行了優(yōu)化，同時將建立的LAMP檢測方法與PCR方法進行了比較分析。結果表明，LAMP檢測最適反應在60.8℃恒溫條件45min內完成，凝膠電泳呈現梯形條帶，與其他常見的細菌無交叉反應。LAMP

4、檢測方法的細菌DNA最低檢出限為35.5fg/反應管，靈敏度較PCR高10倍，而且LAMP方法在1 h內完成檢測，操作簡單，不需復雜儀器，用建立的LAMP方法對扇貝樣品中分離菌株進行了檢測表明，LAMP方法對檢測致病性副溶血弧菌具有很好的可靠性。
　　 多重PCR是在一個反應體系中加入了多對引物，在同一體系中對多個目的片段同時擴增。該方法克服了常規(guī)PCR及LAMP檢測一次只能擴增一個目的片段的缺點。本文探索了一種同時特異性地檢測

5、五種常見食源性致病菌的多重PCR方法。根據目前食品中常見病原菌副溶血弧菌Vibrio parahaemolyticus、金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus、單核細胞增生性李斯特菌 Listeriamonocytogenes、腸炎沙門氏菌 Salmonella enteritidi、福氏志賀氏菌 ShigellaFlexneri的相關毒力基因，選擇具有特異性的副溶血弧菌不耐熱溶血毒素基因(thermolabile h

6、emolysin gene，tlh)、金黃色葡萄球菌的耐熱核酸酶基因(heat stablenuelease gene，nuc)、單核細胞增生性李斯特菌的編碼溶血素O基因hlyA、腸炎沙門氏菌的侵襲蛋白A基因(invasion protein A gene，invA)及志賀氏菌侵襲性質粒抗原H基因(invasion plasmid antigen H gene，ipaH)，分別設計一對特異性引物進行多重PCR檢測，對反應條件進行優(yōu)化并評

7、價了其特異性和靈敏度。通過對扇貝樣品檢測驗證了此多重PCR體系具有很好的可靠性和實用性。
　　 本文建立了基于多重PCR結合基因芯片技術同時檢測副溶血弧菌、金黃色葡萄球菌、單核細胞增生性李斯特菌、沙門氏菌、志賀氏菌、蠟樣芽胞桿菌和溶藻弧菌的方法。選擇副溶血弧菌不耐熱溶血毒素基因、金黃色葡萄球菌的耐熱核酸酶基因、單核細胞增生性李斯特菌編碼溶血素O基因、沙門氏菌侵襲蛋白A基因及志賀氏菌侵襲性質?？乖璈基因進行五重PCR擴增，選擇蠟樣

8、芽胞桿菌非溶血毒素基因(non-haemolytic enterotoxin operon，nheA)和溶藻弧菌類似Rposs因子(Rpos-like sigma factor，rpoX)基因進行兩重PCR，兩組多重PCR擴增產物同時與芯片上的特異性探針雜交，檢測7種食源性致病菌。采用該方法對15種細菌分別進行芯片檢測，僅7種目標菌得到陽性擴增，顯示陽性信號，說明該方法特異性高。通過實驗驗證，基因芯片檢測致病菌的靈敏度較常規(guī)PCR高10