近紅外光譜分析技術(shù)在肝素鈉生產(chǎn)過(guò)程中的應(yīng)用研究.pdf

1、肝素是糖醛酸和葡萄糖胺及它們的衍生物連接而成的具有不同鏈長(zhǎng)的線性多糖，是開(kāi)發(fā)最早、臨床應(yīng)用最廣泛的糖胺聚糖類大分子藥物。這類藥物能夠參與、影響和調(diào)控人體代謝和生理功能，臨床上主要作為抗凝血藥物。此外，它還具有調(diào)血脂、抗炎、抗過(guò)敏以及免疫調(diào)節(jié)等重要功能。肝素是我國(guó)最重要的生化原料藥出口品種之一，占世界肝素原料藥貿(mào)易份額高達(dá)87％。肝素的生產(chǎn)過(guò)程主要是指從肝素原料的評(píng)價(jià)開(kāi)始一直到肝素成品入庫(kù)的整個(gè)過(guò)程。在該過(guò)程中，多硫酸軟骨素（Oversu

2、lfatedChondroitinSulfate，OSCS）這一肝素結(jié)構(gòu)類似物，能夠引起嚴(yán)重的不良反應(yīng)，應(yīng)杜絕其摻入;肝素結(jié)構(gòu)的完整性是保持其生物活性的基礎(chǔ)，在生產(chǎn)中應(yīng)盡量避免肝素結(jié)構(gòu)的破壞;與肝素相結(jié)合的雜蛋白易產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)，生產(chǎn)過(guò)程中必須盡量去除;醇沉環(huán)節(jié)是影響肝素產(chǎn)品質(zhì)量和收率的關(guān)鍵單元操作，應(yīng)嚴(yán)格控制。因此，尋找精準(zhǔn)質(zhì)量控制方法可為保證肝素鈉質(zhì)量，保障廣大人民的用藥安全提供重要的技術(shù)支持。但實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)控制的前提是對(duì)工藝過(guò)程的深刻理

3、解，這就需要有效的過(guò)程分析技術(shù)做保證。
　　 近紅外光譜分析技術(shù)（Near-infraredSpectroscopy，NIRS）作為一種快速、有效的過(guò)程分析方法，已經(jīng)在化工等領(lǐng)域的過(guò)程分析中驗(yàn)證了其應(yīng)用價(jià)值，但是在肝素鈉等糖胺聚糖類藥物過(guò)程分析中的應(yīng)用還沒(méi)有研究。
　　 本文以肝素鈉的精制過(guò)程為研究對(duì)象，利用NIRS和化學(xué)計(jì)量學(xué)方法對(duì)肝素鈉原料中的雜質(zhì)OSCS及生產(chǎn)過(guò)程中離子交換、醇沉等關(guān)鍵單元操作的快速檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行了研

4、究，并針對(duì)肝素鈉成品效價(jià)的測(cè)定進(jìn)行了近紅外光譜波段選擇的研究。為近紅外光譜法應(yīng)用于肝素鈉生產(chǎn)過(guò)程的質(zhì)量控制奠定了理論基礎(chǔ)。
　　 本課題研究?jī)?nèi)容及取得的主要成果有以下幾個(gè)方面:
　　 1.NIRS用于肝素原料藥中OSCS的快速檢測(cè)方法研究
　　 本研究采用偏最小二乘β判別(PartialLeastSquaresBetaClassification，PLSBC)和K-最鄰近距離算法(K-nearestNeighbo

5、r，KNN)兩種模式識(shí)別方法分別對(duì)93份肝素鈉原料藥樣品(47份不含有OSCS的精品肝素鈉樣品，46份含有OSCS的肝素鈉樣品)的近紅外光譜進(jìn)行了定性判別分析，分別選擇34份不含有OSCS的精品肝素鈉樣品和34份含有OSCS的肝素鈉樣品建立定性分析模型，并利用剩余樣品對(duì)模型進(jìn)行驗(yàn)證。PLSBC驗(yàn)證結(jié)果表明當(dāng)OSCS的含量大于0.7％時(shí)，可以有效地判別出含有OSCS的肝素鈉樣品。KNN驗(yàn)證結(jié)果表明所建KNN模型能夠100％正確判別樣品中是

6、否含有OSCS。為進(jìn)一步驗(yàn)證不同含量OSCS與不含有OSCS的精品肝素鈉的關(guān)系，將不含有OSCS的精品肝素鈉作為A等級(jí)，并根據(jù)OSCS含量的不同，將含有OSCS的肝素鈉樣品劃分為5個(gè)含量等級(jí)，分別為B、C、D、E和F，OSCS含量等級(jí)判別時(shí)模型的判斷正確率達(dá)83.33％。以上結(jié)果表明，運(yùn)用NIRS可鑒別肝素鈉樣品中是否含有OSCS，這可為實(shí)際生產(chǎn)中原料藥中是否含有OSCS提供可靠且快速的檢測(cè)方法。
　　 2.NIRS用于快速監(jiān)測(cè)

7、粗品肝素離子交換層析過(guò)程的研究
　　 本研究選取肝素離子交換純化過(guò)程流出液為對(duì)象，收集80份吸附過(guò)程樣品和76份洗脫過(guò)程樣品，采用偏最小二乘（PartialLeastSquares，PLS）算法分別建立吸附過(guò)程和洗脫過(guò)程流出液中肝素含量的NIRS定量分析模型。通過(guò)模型優(yōu)化，最終選取光譜特征點(diǎn)8666cm-1、7160cm-1、5365cm-1建立吸附過(guò)程肝素含量定量分析模型，驗(yàn)證集預(yù)測(cè)均方根誤差(RMSEP)=0.29g/L，驗(yàn)

8、證集相關(guān)系數(shù)Rp=0.957，驗(yàn)證集標(biāo)準(zhǔn)偏差與預(yù)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)偏差的比值RPD=3.4472;選取6098-5802cm-1這一波段范圍建立洗脫過(guò)程肝素含量定量分析模型，RMSEP=3.55g/L，Rp=0.9647，RPD=3.9849。并按照樣品批次將模型預(yù)測(cè)含量與參考值進(jìn)行比較，肝素含量測(cè)定的參考值和近紅外光譜模型預(yù)測(cè)值繪制的肝素含量變化趨勢(shì)基本接近。所建方法具有快速、無(wú)損等優(yōu)點(diǎn)，無(wú)需復(fù)雜的樣品前處理，可直接對(duì)流出液樣品進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)層析

9、過(guò)程的實(shí)時(shí)跟蹤。
　　 3.NIRS用于醇沉過(guò)程中肝素鈉含量的測(cè)定研究
　　 本研究通過(guò)模擬肝素鈉的醇沉過(guò)程，收集5批共80個(gè)醇沉過(guò)程樣品，離心后取上清，采集上清的近紅外光譜并測(cè)定其肝素含量。首先采用主成分分析(PrincipalComponentAnalysis，PCA)對(duì)醇沉過(guò)程進(jìn)行光譜的特征性分析，不同批次之間主成分的變化趨勢(shì)基本一致，第一主成分隨著時(shí)間的推移得分不斷的增加，揭示了乙醇量的不斷增加;第二主成分可以較

10、好的反應(yīng)醇沉體系的穩(wěn)定程度，開(kāi)始向溶液中加入乙醇，肝素大量沉淀出來(lái)，體系的穩(wěn)定性被破壞，在30-40min時(shí)，溶液中肝素的含量變化曲線出現(xiàn)拐點(diǎn)，主成分的得分也相應(yīng)到達(dá)拐點(diǎn);之后溶液中的肝素含量很低，體系又慢慢趨于穩(wěn)定。結(jié)果表明通過(guò)PCA得分圖的變化規(guī)律，可以很好地揭示整個(gè)肝素醇沉過(guò)程的變化趨勢(shì)。其次，采用一階導(dǎo)數(shù)SG15點(diǎn)平滑、交叉驗(yàn)證選取3個(gè)主成分?jǐn)?shù)，在9034.87-8940.37cm-1、8649.17-8554.68cm-1、7

11、974.21-7686.87cm-1、7395.67-7301.18cm-1以及5949.32-5758.4cm-1的波數(shù)范圍建立肝素含量的PLS定量分析模型，絕對(duì)系數(shù)R2=0.974，交互驗(yàn)證均方根誤差(RMSECV)=1.4089g/L，用建立的模型對(duì)結(jié)果進(jìn)行預(yù)測(cè)，RMSEP=1.1054g/L。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明運(yùn)用NIRS監(jiān)測(cè)醇沉母液中肝素含量準(zhǔn)確度和精密度均能滿足工廠需要。
　　 4.肝素鈉精品效價(jià)和近紅外光譜之間的關(guān)聯(lián)性研

12、究
　　 本研究對(duì)47份效價(jià)分布范圍在154-162IU/mg的肝素鈉精品進(jìn)行效價(jià)與近紅外光譜之間的關(guān)聯(lián)性探討。通過(guò)對(duì)肝素鈉精品的效價(jià)與近紅外光譜建立PLS模型，預(yù)測(cè)肝素鈉精品的效價(jià)，同時(shí)考察了相關(guān)系數(shù)法、間隔偏最小二乘法(intervalPLS，iPLS)、連續(xù)投影算法(SuccessiveProjectionsAlgorithm，SPA)三種波段選擇方法對(duì)模型預(yù)測(cè)能力的影響以及吸光度、效價(jià)、結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系。結(jié)果表明相關(guān)系數(shù)法

13、所選擇的波段具有最佳的模型參數(shù)，Rp=0.8868，RMSEP=0.7925IU/mg，RMSECV=1.2786IU/mg。相關(guān)系數(shù)法選擇的波段分布范圍較廣，涵蓋C-H鍵振動(dòng)的一級(jí)倍頻、二級(jí)倍頻、組合頻，1800-2100nm的強(qiáng)烈吸收是由于O-H鍵的組合頻引起，這些吸收區(qū)間均與肝素的結(jié)構(gòu)有很大相關(guān)性，包含了肝素結(jié)構(gòu)的諸多有效信息，因此相關(guān)系數(shù)法所選擇的波段能產(chǎn)生最優(yōu)的預(yù)測(cè)結(jié)果。
　　 本研究取得的主要?jiǎng)?chuàng)新性成果有以下幾個(gè)方面

14、:
　　 1.研究建立了利用近紅外光譜結(jié)合PLSBC法和KNN法鑒別肝素鈉原料藥中OSCS的方法;
　　 2.研究建立了利用近紅外光譜定量監(jiān)測(cè)粗品肝素離子交換過(guò)程肝素含量分析方法;
　　 3.研究建立了利用近紅外光譜定性和定量分析醇沉過(guò)程肝素鈉含量變化的方法;
　　 4.對(duì)肝素鈉精品效價(jià)和近紅外光譜之間的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行了研究，優(yōu)化了近紅外光譜定量分析肝素鈉精品效價(jià)的模型。
　　 5.揭示了近紅外光譜與