阿維拉霉素高產(chǎn)菌株選育.pdf

1、阿維拉霉素是一種正糖霉素族中的寡糖類(lèi)抗生素，作為一種新型促進(jìn)消化和代謝調(diào)節(jié)飼料藥物添加劑，以其高安全性、低毒性以及低殘留被歐盟等國(guó)家批準(zhǔn)使用。本文通過(guò)誘變及基因組重排的方法并結(jié)合利福平抗性壓力，選育了高產(chǎn)阿維拉霉素生產(chǎn)菌。通過(guò)rpoB序列分析，闡述了重組菌利福平遺傳抗性及代謝特性。建立了發(fā)酵液中阿維拉霉素?zé)o鹽相液相色譜測(cè)量法。
　　經(jīng)過(guò)四輪誘變與兩輪原生質(zhì)體融合，得到2株融合高產(chǎn)菌株G2-10與G2-31，其阿維拉霉素效價(jià)分別達(dá)到

2、2242.64 mg/L與2471.41mg/L，是原始菌株11-10的3.16倍和3.48倍。經(jīng)連續(xù)傳代試驗(yàn)，菌株性狀穩(wěn)定，表現(xiàn)出較高的工業(yè)應(yīng)用潛力。
　　重組菌G2-31的利福平抗性較原始菌株有較大提高(800 mg/L)。rpoB基因測(cè)序表明RpoB蛋白多肽鏈中存在點(diǎn)突變，G61D，S76N以及C104A，其中S76N突變與文獻(xiàn)報(bào)道一致。
　　原始菌株與突變株生長(zhǎng)及產(chǎn)物合成特性比較研究表明，突變株阿維拉霉素合成存在二次

3、積累期。突變株生長(zhǎng)停滯期比較長(zhǎng)。低產(chǎn)突變株與高產(chǎn)突變株的主要區(qū)別在于阿維拉霉素二次積累期的長(zhǎng)短，并與生物量關(guān)聯(lián)。高產(chǎn)菌株在前期快速生長(zhǎng)階段菌絲生物量增加，阿維拉霉素幾乎不合成;阿維拉霉素在生長(zhǎng)停滯階段細(xì)胞有明顯的積累，且在生長(zhǎng)后期繼續(xù)積累。二次積累期是從生長(zhǎng)到凋亡的一個(gè)小型周期。由此可推測(cè)阿維拉霉素代謝產(chǎn)物的積累主要在菌絲生長(zhǎng)停滯期及凋亡延滯前期。
　　基于預(yù)混劑阿維拉霉素的測(cè)定方法，本文針對(duì)菌株發(fā)酵液的特殊性，重新建立了無(wú)鹽相方

4、法并通過(guò)質(zhì)譜驗(yàn)證。確定的色譜條件為:色譜柱:C18（230 mm×4.6 mm，5岬）柱，柱溫:30℃，流速:1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng):220 nm，進(jìn)樣量:20μL，以梯度方法調(diào)整流動(dòng)相A液（色譜純甲醇）與B液（超純水）的比例。在該色譜條件下，發(fā)酵液中阿維拉霉素浸提樣品中各組分分離效果比較好，色譜峰峰型對(duì)稱(chēng)。經(jīng)液質(zhì)聯(lián)用，驗(yàn)證了發(fā)酵液中阿維拉霉素單組分阿維拉霉素A和阿維拉霉素B的出峰時(shí)間分別為33 min和22.9 min，并且此方法