高效表達黑曲霉葡萄糖氧化酶基因工程菌的構(gòu)建.pdf

1、葡萄糖氧化酶(EC1.1.3.4)是一種能夠催化β-D-葡萄糖被分子氧氧化成葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯，并生成過氧化氫的氧化還原酶。葡萄糖氧化酶應(yīng)用廣泛，如可用于葡萄糖傳感器制造、去除食品中多余糖分、葡萄糖酸及其鹽的生產(chǎn)和燃料電池的制造等領(lǐng)域。但是過高的生產(chǎn)成本嚴重限制了其應(yīng)用。為了降低其生產(chǎn)成本，本研究從實驗室保藏的黑曲霉中克隆葡萄糖氧化酶基因，并以巴斯德畢赤酵母進行表達。
　　本研究首先通過透明圈初篩和搖瓶發(fā)酵復(fù)篩的方法，從實驗室保藏

2、的黑曲霉菌株中優(yōu)選獲得一株對葡萄糖轉(zhuǎn)化能力較強的黑曲霉菌株QYW3221，以此作為出發(fā)菌株進行葡萄糖氧化酶基因的克隆。為了在后續(xù)研究中能夠準確測定葡萄糖氧化酶的活力，對連續(xù)分光光度法和滴定法測定葡萄氧化酶活力進行了對比研究，發(fā)現(xiàn)對于連續(xù)分光光度法和滴定法，酶活力分別在0.044-0.351U/mL和1.125-5.321U/mL時線性關(guān)系較好；對于連續(xù)分光光度法，在此范圍內(nèi)可以用兩點法代替標準方法進行測定；相同的樣品采用滴定法測定的結(jié)果

3、要高于連續(xù)分光光度法，兩種方法測定數(shù)值的換算關(guān)系為：滴定法測定值=（連續(xù)分光光度法測定值+0.1454）×1.2868+0.3793。連續(xù)分光光度法對于大量樣品的測定更具優(yōu)勢。通過比對已經(jīng)發(fā)表的黑曲霉葡萄糖氧化酶基因序列，找出其保守區(qū)域并設(shè)計引物克隆到了一段長度為1852bp序列，含有一個1818bp的編碼區(qū)。通過BLAST比對證明已經(jīng)克隆到黑曲霉葡萄糖氧化酶基因。使用SignalP4.0預(yù)測信號肽序列，發(fā)現(xiàn)有一個16個氨基酸組成的信號