高效表達(dá)黑曲霉葡萄糖氧化酶基因工程菌的構(gòu)建.pdf

1、葡萄糖氧化酶(EC1.1.3.4)是一種能夠催化β-D-葡萄糖被分子氧氧化成葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯，并生成過(guò)氧化氫的氧化還原酶。葡萄糖氧化酶應(yīng)用廣泛，如可用于葡萄糖傳感器制造、去除食品中多余糖分、葡萄糖酸及其鹽的生產(chǎn)和燃料電池的制造等領(lǐng)域。但是過(guò)高的生產(chǎn)成本嚴(yán)重限制了其應(yīng)用。為了降低其生產(chǎn)成本，本研究從實(shí)驗(yàn)室保藏的黑曲霉中克隆葡萄糖氧化酶基因，并以巴斯德畢赤酵母進(jìn)行表達(dá)。
　　本研究首先通過(guò)透明圈初篩和搖瓶發(fā)酵復(fù)篩的方法，從實(shí)驗(yàn)室保藏

2、的黑曲霉菌株中優(yōu)選獲得一株對(duì)葡萄糖轉(zhuǎn)化能力較強(qiáng)的黑曲霉菌株QYW3221，以此作為出發(fā)菌株進(jìn)行葡萄糖氧化酶基因的克隆。為了在后續(xù)研究中能夠準(zhǔn)確測(cè)定葡萄糖氧化酶的活力，對(duì)連續(xù)分光光度法和滴定法測(cè)定葡萄氧化酶活力進(jìn)行了對(duì)比研究，發(fā)現(xiàn)對(duì)于連續(xù)分光光度法和滴定法，酶活力分別在0.044-0.351U/mL和1.125-5.321U/mL時(shí)線性關(guān)系較好；對(duì)于連續(xù)分光光度法，在此范圍內(nèi)可以用兩點(diǎn)法代替標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行測(cè)定；相同的樣品采用滴定法測(cè)定的結(jié)果

3、要高于連續(xù)分光光度法，兩種方法測(cè)定數(shù)值的換算關(guān)系為：滴定法測(cè)定值=（連續(xù)分光光度法測(cè)定值+0.1454）×1.2868+0.3793。連續(xù)分光光度法對(duì)于大量樣品的測(cè)定更具優(yōu)勢(shì)。通過(guò)比對(duì)已經(jīng)發(fā)表的黑曲霉葡萄糖氧化酶基因序列，找出其保守區(qū)域并設(shè)計(jì)引物克隆到了一段長(zhǎng)度為1852bp序列，含有一個(gè)1818bp的編碼區(qū)。通過(guò)BLAST比對(duì)證明已經(jīng)克隆到黑曲霉葡萄糖氧化酶基因。使用SignalP4.0預(yù)測(cè)信號(hào)肽序列，發(fā)現(xiàn)有一個(gè)16個(gè)氨基酸組成的信號(hào)