生物小分子檢測(cè)的非標(biāo)熒光生物傳感新方法研究.pdf

1、ATP是一種高能磷酸鹽復(fù)合物，作為能量?jī)?chǔ)存的分子廣泛存在于生物體中。它參與著活細(xì)胞的新陳代謝活動(dòng)，如細(xì)胞機(jī)能、膜運(yùn)輸、重要細(xì)胞化合物的合成與分解等。生物體內(nèi)ATP的含量能夠?qū)?xì)胞的代謝和死亡產(chǎn)生重大的影響。已有許多疾病的發(fā)生被證實(shí)與ATP的含量異常有關(guān)，例如心血管疾病、帕金森癥和阿爾茨海默氏癥。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)作為一種輔酶，在許多細(xì)胞中的新陳代謝反應(yīng)中起到傳遞質(zhì)子（即氫離子）的作用，是活細(xì)胞中關(guān)鍵的電荷載體。NAD+在細(xì)

2、胞增殖、細(xì)胞衰亡、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、DNA修復(fù)、鈣穩(wěn)態(tài)、熱量控制介導(dǎo)壽命延長(zhǎng)等生物學(xué)過(guò)程中也扮演著關(guān)鍵的角色。
　　 非標(biāo)記熒光傳感方法憑借快速方便、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)引起了越來(lái)越多研究者的關(guān)注。因此，本論文以生物小分子ATP、NAD+為研究對(duì)象，發(fā)展了一系列非標(biāo)熒光傳感方法，具體內(nèi)容包括:
　　 (1)在第二章中，采用基于切刻內(nèi)切酶信號(hào)放大(NESA)與G-四鏈體的非標(biāo)熒光傳感方法對(duì)三磷酸腺苷(ATP)進(jìn)行檢測(cè)。將N-甲基卟

3、啉二丙酸Ⅸ(NMM)作為信號(hào)響應(yīng)物質(zhì)，引入NESA技術(shù)，研究出一種新型靈敏的非標(biāo)記檢測(cè)ATP的傳感方法。在這種檢測(cè)方法中，T4 DNA連接酶以ATP為輔助因子，引發(fā)缺口連接反應(yīng)。接著再利用NESA技術(shù)進(jìn)行循環(huán)放大，產(chǎn)生許多富G序列，加入一價(jià)離子后形成能與NMM發(fā)生特異性結(jié)合的G-四鏈體結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生顯著增強(qiáng)的熒光信號(hào)。這種非標(biāo)記熒光傳感方法的動(dòng)力學(xué)范圍為10 nM到1000 nM，檢測(cè)下限為0.8 nM，表現(xiàn)出了簡(jiǎn)單、靈敏度和選擇性高的優(yōu)點(diǎn)

4、。
　　 (2)在第三章中，結(jié)合缺口連接反應(yīng)與G-四鏈體結(jié)構(gòu)，運(yùn)用非標(biāo)熒光傳感方法檢測(cè)輔酶。以NAD+作為E.coli DNA連接酶的輔酶引發(fā)缺口反應(yīng)，并基于G-四鏈體結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)一種非標(biāo)記型熒光DNA探針，間接實(shí)現(xiàn)了對(duì)輔酶NAD+的有效分析，檢測(cè)下限達(dá)到0.5 nM。這種設(shè)計(jì)既保留了熒光傳感器的優(yōu)點(diǎn)，又不需要對(duì)DNA探針進(jìn)行標(biāo)記，大大節(jié)約了成本，具有高靈敏度與高選擇性的優(yōu)點(diǎn)，能夠幫助人們更好的理解輔酶在生化過(guò)程中發(fā)揮的重要作用。<

5、br>　　 (3)在第四章中，將氧化石墨烯(GO)引入非標(biāo)熒光適配體方法中，結(jié)合GO獨(dú)特的對(duì)單雙鏈DNA的吸附差異和優(yōu)良的熒光淬滅特性，采用高靈敏的有機(jī)熒光染料SYBR GreenⅠ(SG)，對(duì)ATP進(jìn)行分析檢測(cè)。我們將ATP的適配體序列劈開(kāi)成兩部分，設(shè)計(jì)了兩條無(wú)標(biāo)記的DNA鏈，分別包含ATP的部分適配體序列。當(dāng)目標(biāo)ATP存在時(shí)，ATP結(jié)合兩條探針形成不能被GO吸附的雙鏈-ATP夾心復(fù)合物，嵌SG于夾心復(fù)合物中，通過(guò)檢測(cè)SG的熒光發(fā)射