廣西欽州灣紅樹林抗菌活性菌株篩選及活性化合物的分離鑒定.pdf

1、處于“海洋——陸地”界面潮間帶廣西欽州灣紅樹林濕地生態(tài)系統(tǒng)因其輻射強(qiáng)、鹽堿化、沼澤化和有機(jī)物質(zhì)含量高等自然環(huán)境特征，使其在生物活性物質(zhì)方面的研究和開發(fā)中具有十分顯著的優(yōu)勢(shì)和特點(diǎn)。紅樹林生態(tài)系統(tǒng)不僅是發(fā)現(xiàn)新的微生物物種和遺傳資源的寶庫，同時(shí)是發(fā)現(xiàn)新型抗菌活性化合物的資源寶庫。
　　以金黃色葡萄球菌為指示菌，通過瓊脂擴(kuò)散法對(duì)廣西欽州灣紅樹林采集的根系泥中的476株菌株進(jìn)行初篩和復(fù)篩，得到了12株具有明顯抑菌效果的菌株，分別給其編號(hào)為1

2、-2-3、1-3-1、2-2、2-3、3-4-1、4-4-1、5-2、5-8、6-4-2、6-9、7-3-3、8-3-21。其中，5-8的抑菌強(qiáng)度最大。測(cè)定菌株5-8的抑菌譜、菌株生長曲線和抗菌活性，并且對(duì)菌株5-8進(jìn)行分子鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析的研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌株5-8對(duì)金黃色葡萄球菌、尖孢鐮孢菌、辣椒疫霉菌、大麗輪枝菌、瓜亡革菌、大腸埃希菌均有較強(qiáng)的抑制作用。由菌株的生長曲線和抑菌曲線可知，菌株5-8在培養(yǎng)12h后進(jìn)入對(duì)數(shù)期，60h后

3、進(jìn)入穩(wěn)定期；菌株5-8在24h后出現(xiàn)抑菌活性，并且抑菌強(qiáng)度在120h達(dá)到最大。分子鑒定與系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，從廣西欽州灣紅樹林中分離到的活性菌株5-8為細(xì)菌域(Bacteria)變型菌門(Proteobacteria)變形菌綱（Gammaproteobacteria）歐文氏菌屬（Erwinia）。
　　在單因素實(shí)驗(yàn)發(fā)酵條件（不同氮源、不同碳源、培養(yǎng)溫度、初始pH、鹽度、接種量、裝液量）基礎(chǔ)上，利用Plackett-Burman篩

4、選出對(duì)菌株抑菌活性有顯著影響的3個(gè)因素，分別為溫度、鹽度和蛋白胨濃度，在Plackett-Burman基礎(chǔ)上通過最陡爬坡實(shí)驗(yàn)逼近最佳響應(yīng)面區(qū)域；再采用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析法對(duì)結(jié)果進(jìn)行回歸分析，確定對(duì)菌株抑菌活性具有顯著影響的3個(gè)因素的最優(yōu)條件。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，廣西欽州灣紅樹林菌株Erwinia sp.5-8的最佳發(fā)酵條件：溫度為26.004℃，初始鹽度為0.9648％，蛋白胨的濃度為0.2696%，葡萄糖濃度為0.6%，

5、初始pH為8.5，初始裝液量為40%(V/V)，初始接種量為1%。在此最優(yōu)條件下菌株Erwinia sp.5-8發(fā)酵液的抗菌活性比優(yōu)化前提高了8.95%。
　　菌株Erwinia sp.5-8發(fā)酵液抗菌活性物質(zhì)的穩(wěn)定性和極性研究結(jié)果表明，在發(fā)酵液保存時(shí)間(0-8周)、溫度(30℃-60℃)、pH(6.0-10.0)的條件下，發(fā)酵液的活性均保持在90%以上，菌株產(chǎn)生的抑菌活性物質(zhì)采用乙酸乙酯萃取效果最好。運(yùn)用活性跟蹤檢測(cè)的方法，采用