KRN4順式調控UB3影響玉米穗行數(shù)的分子機理.pdf

1、禾本科單子葉植物水稻和玉米，分支均包括葉腋分生組織(axillary meristems:AMs)產(chǎn)生的分蘗和花序分支分生組織(branch meristems:BMs)產(chǎn)生的花序分支。研究表明，參與調控分蘗和穗分支的基因，在水稻和玉米中具有一定的同源性。unbranched3(UB3)屬于SBP-box轉錄因子家族的基因，通過調控腋芽原基的起始來影響雄穗分支和雌穗穗行數(shù)的變異，進而影響產(chǎn)量，但是其作用機理并不清楚。KRN4是一個穗行數(shù)

2、主效位點，為UB3下游～60kb處的基因間區(qū)域，UB3的表達與功能位點KRN4的基因型顯著關聯(lián)，但是KRN4遠距離調控UB3的作用方式還有待解析。本研究將UB3在玉米和水稻中進行遺傳轉化，解析了UB3在水稻和玉米中影響穗分支發(fā)育的功能，為禾本科植物基部的分蘗和花序分支系統(tǒng)的建立提供基礎。此外，還研究了KRN4遠距離調控UB3表達的作用方式，建立了假說，為非編碼基因間區(qū)調控基因表達提供了依據(jù)。主要結果如下
　　1.UB3過量表達抑制

3、玉米愈傷的分化和水稻分支的發(fā)育:將UB3在玉米進行過表達，顯著抑制愈傷的分化和再生，不能形成幼苗;將UB3在水稻中進行遺傳轉化，UB3過表達時，顯著抑制株高、分蘗和穗分支;UB3適度表達時，輕微的減少分蘗和株高，并增加穗分支和穗粒數(shù)。
　　2.UB3通過細胞分裂素水平調控水稻分支發(fā)育:對UB3過量表達的轉基因株系的莖尖分生組織和幼穗進行轉錄組測序，結合已有的Ideal Plant Architecture1(IPA1)Chroma

4、tin Immunoprecipitation quantitative PCR(ChIP-seq)的數(shù)據(jù)進行分析，并結合體外驗證，發(fā)現(xiàn)UB3蛋白可以結合在LONELY GUY1（LOG1），LOC_OS04G44354和OsCKX2基因的啟動子區(qū)域，在UB3過量表達材料中，降低細胞分裂素的合成并促進其降解，使得分生組織細胞分裂素水平降低。對水稻苗期地上部分進行細胞分裂素水平的測量，發(fā)現(xiàn)UB3過表達植株中細胞分裂素含量確實有所降低，符合

5、預期。因此UB3通過影響分生組織中細胞分裂素的水平，影響細胞分裂的速率，從而參與腋生分生組織分支發(fā)育的調控。而UB3適量表達時，可以通過與SPL(SPL7，SPL14，SPL17)基因合作，精準調控小穗的發(fā)育。
　　3.UB3可能通過細胞分裂素途徑和CLAVATA-WUSCHEL途徑調控玉米穗行數(shù)發(fā)育:對ub3::mum和野生型株系的幼穗進行轉錄組測序，發(fā)現(xiàn)在所有的與細胞分裂素相關的差異表達基因中，17個與之合成相關的基因在突變體

6、中上調表達，3個與之降解途徑相關的基因下調表達。因此認為細胞分裂素途徑在UB3調控玉米穗行數(shù)發(fā)育過程中也存在。此外，影響玉米分生組織發(fā)育的CLAVATA-WUSCHEL負反饋調控途徑上的一些基因，包括THICK TASSEL DWARF1(td1)，F(xiàn)ASCIATED EAR2(fea2),COMPACT PLANT2(ct2)和FASCIATED EAR3(fea3),FON2-LIKE CLE PROTEIN1(ZmFCP1),WU

7、SCHEL1(ZmWUS1)和CLA VATA3(ZmCLV3)均檢測到有差異表達，結合體外的實驗，證明了UB3蛋白可以直接結合在ZmFCP1，ZmWUS1的啟動子區(qū)域，直接調控它們的表達。
　　4.KRN4順式增強UB3的表達:KRN4是一個基因間區(qū)域，在負調控穗行數(shù)的功能基因UB3下游～60Kb處。在krn4-mum12-3mm的雌穗中，UB3的表達量相對于野生型顯著下降，成熟時期雌穗的穗行數(shù)、雄穗的一級分支數(shù)、二級分支數(shù)等均

8、顯著高于野生型。KRN4在不同的玉米自交系中存在兩種不同的單倍型，即KRN4NX和KRN4，KRN4NX較KRN4存在1.2kb的插入。瞬時表達的結果表明，不同單倍型的KRN4均能增強報告基因的表達，并且KRN4的增強效應要強于KRN4NX，KRN4也可以直接作用于pUB3，產(chǎn)生相同趨勢的變化差異。
　　5.KRN4的結合蛋白分析:通過酵母單雜、凝膠阻滯遷移和瞬時表達實驗，驗證了玉米OCS Element Binding Fact

9、orsl(OBFl)和OCS Element Binding Factors4(OBF4)可以結合在KRN4的E1增強子元件，并增強熒光素酶報告基因的表達。
　　6.UB2正調控UB3表達:UB2是UB3的旁系同源基因，UB2和UB3的雙突變體能加強ub2或ub3單突變體穗部的表型。在UB2過表達植株和突變體ub2::mum的幼穗中，發(fā)現(xiàn)UB2正調控UB3表達。通過UB2超表達轉基因株系幼穗的ChIP-qPCR，發(fā)現(xiàn)UB2結合在K

10、RN4-P4位點以及UB3-P位點。并且雙分子熒光互補實驗表明UB2，OBF1和OBF4兩兩之間存在互作。
　　7.總結KRN4順式調控UB3影響玉米穗行數(shù)的途徑:UB2蛋白介導KRN4和UB3transcription start site(TSS)之間染色質環(huán)的形成，使得KRN4在空間上靠近UB3的啟動子區(qū)域;KRN4招募OBF1和OBF4蛋白，與UB2蛋白形成轉錄復合體作用于UB3的啟動子區(qū)域，在RNA polymerase