四種農業(yè)生境昆蟲內生放線菌的篩選、鑒定及抗菌活性研究.pdf

1、天然產物(Natual Products)是普遍地存在于整個生態(tài)系統(tǒng)的特殊物質，是生物活性物質和實用藥物發(fā)現(xiàn)的重要源泉，在人類的社會生活中扮演了重要角色。隨著抗生素耐藥性問題的日益嚴峻，迫使新藥的研發(fā)效率急需不斷提高。目前，從傳統(tǒng)分離源中分離新活性天然產物的幾率不斷地降低，進而新分離源的探索不斷引起研究者的關注。昆蟲種類豐富，其分布也極為廣泛，幾乎遍布地球上的各種生境。昆蟲共生微生物的獨特活性代謝產物，也引起了研究者們的極大興趣。其中，

2、昆蟲共生放線菌的活性代謝產物研究不斷受到研究者的關注。因此，本研究以昆蟲綱中第一大目鞘翅目甲蟲為分離研究對象，進行內生放線菌多樣性研究。將篩選獲得的內生放線菌進行新種鑒定和抗病原微生物活性評價，并對活性菌株的活性代謝產物進行分離鑒定，結果如下:
　　(1)從多種昆蟲樣本中共分離得到內生放線菌41株，通過形態(tài)特征、培養(yǎng)特征及部分16S rRNA分析，將這41株菌歸類為放線菌的4個屬，包括鏈霉菌屬（Streptomyces）27株，小

3、單孢菌屬（Micromonospora）11株，鏈孢囊菌屬（Streptosporangium）2株及野野村菌屬（Nonom uraea）1株。
　　(2)綜合運用多相性分類鑒定方法對菌株NEAU-CX1進行分類學鑒定。通過16S rRNA基因序列分析判斷該菌屬于小單孢菌屬。菌株NEAU-CX1與Micromonospora coxensis JCM13248T(99.3％),Micromonospora purpureochro

4、mogenes DSM43821T(99.1％)和Micromonospora siamensis TT2-4 JCM12769T(99.1％)的16S rRNA基因序列相似性最高，與小單孢菌屬的其它菌株的相似性均低于99％。利用鄰位連接法和最大似然法將菌株NEAU-CX1與該屬的相關菌株的16S rRNA和gryB基因進行系統(tǒng)發(fā)育樹構建，分析結果表明，兩種方法得到的拓撲結構相同，菌株NEAU-CX1與M.purpureochromog

5、enes DSM43821T形成獨立分支。通過形態(tài)特征、生理生化特性、系統(tǒng)分類學及DNA雜交分析確定NEAU-CX1屬于小單孢菌屬的一個新種，命名為Micromonospora palomenae，保藏在中國科學院微生物研究所和日本理化學研究所微生物菌種保藏中心(=CGMCC4.7175T=JCM30056T)。
　　(3)綜合運用多相性分類鑒定方法對菌株NEAU-JC6進行分類學鑒定。通過16S rRNA基因序列分析判斷該菌屬于

6、小單孢菌屬。菌株NEAU-JC6與M.haikouensis DSM45626T(99.3％),M.carbonacea JCM3139T(99.1％)和M.krabiensis JCM12869T(99.1％)的16SrRNA基因序列相似性最高，與小單孢菌屬其它菌株的相似性均低于98％。利用鄰位連接法和最大似然法將菌株NEAU-JC6與該屬的相關菌株的16S rRNA和gryB基因進行系統(tǒng)發(fā)育樹構建，分析結果表明，兩種方法得到的拓撲結

7、構相同，菌株NEAU-JC6與M.haikouensis DSM45626T形成獨立分支。通過形態(tài)特征、生理生化特性、系統(tǒng)分類學及DNA雜交分析確定NEAU-JC6屬于小單孢菌屬的一個新種，命名為Micromonospora harpali，保藏在中國科學院微生物研究所和日本理化學研究所微生物菌種保藏中心(=CGMCC4.7173T=JCM30055T)。
　　(4)綜合運用多相性分類鑒定方法對菌株NEAU-FHSN1進行分類學鑒

8、定。通過16SrRNA基因序列分析判斷該菌屬于鏈孢囊菌屬。菌株NEAU-FHSN1與Streptosporangtumshengliensis NEAU-GH7T(98.7％)的16S rRNA基岡序列相似性最高。利用鄰位連接法和最大似然法將菌株NEAU-FHSN與該屬的相關菌株的16S rRNA基因進行系統(tǒng)發(fā)育樹構建，分析結果表明，兩種方法得到的拓撲結構相同，菌株NEAU-FHSN1與Streptosporangtum roseumJ

9、CM3005T(98.6％),Streptosporangtum vulgare DSM43802T(98.6％),Streptosporangtumcanum HBUM170018T(98.5％)和Streptosporangtum album DSM43023T(98.4％)形成一個獨立的分枝，與最高相似度菌株S.shengliensis NEAU-GH7T(98.7％)分枝距離較遠。通過形態(tài)特征、生理生化特性、系統(tǒng)分類學及DNA雜

10、交分析確定NEAU-FHSN1屬于鏈孢囊菌屬的一個新種，命名為Streptosporangium lutulentum，保藏在中國科學院微生物研究所和德國不倫瑞克市德國菌種保藏中心(=CGMCC4.7141T=DSM46740T)。
　　(5)通過對41株共生放線菌進行生物活性體外測試，得到2株生物活性較好的菌株，分別為C7(NEAU-TLV1)和C24(NEAU-T4)，其中C7發(fā)酵產物對受試細菌活性較好，C24發(fā)酵產物對受試植