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文檔簡介
1、目的:
本研究利用本室早期構(gòu)建的pET24a-SA-L-hIFN-α2a重組表達質(zhì)粒,在大腸桿菌中表達融合蛋白SA-hIFN-α2a,并對所表達的蛋白采用鎳金屬螯合(Ni-NTA)層析進行純化,尿素梯度透析復(fù)性,大量制備鏈親合素(SA)標記的人源α2a型干擾素融合蛋白(SA-hIFN-α2a),并對其體外活性進行檢測,為進一步的動物實驗奠定基礎(chǔ)。
方法:
1.誘導(dǎo)表達SA-hIFN-α2a融合蛋
2、白
用傳統(tǒng)的CaCl2方法制備Rosetta感受態(tài)細胞,首先從大腸桿菌DH5α(由本室保存,含質(zhì)粒pET24a-SA-L-hIFN-α2a)中提取目的質(zhì)粒,將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細胞中進行活化,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達,高壓細胞破碎儀破菌,包涵體洗滌。最后應(yīng)用SDS-PAGE分析檢測表達產(chǎn)物。
2.融合蛋白SA-hIFN-α2aIPTG誘導(dǎo)條件的優(yōu)化
通過調(diào)整IPTG的誘導(dǎo)時間和誘導(dǎo)濃度,應(yīng)用SDS-PA
3、GE鑒定結(jié)果,篩選出最佳的誘導(dǎo)條件。
3.WesternBloting鑒定SA-hIFN-α2a融合蛋白的表達
通過對未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達的菌液和表達后的產(chǎn)物進行免疫印跡分析鑒定,以hIFN-α2a抗體為一抗,以辣根過氧化物酶(HRP)標記-羊抗鼠IgG為二抗,采用DAB顯色法進行顯色,以鑒定SA-hIFN-α2a融合蛋白的表達情況。
4.包涵體洗滌、純化及復(fù)性
通過細胞壓力破碎儀
4、破菌收得包涵體(鎳柱親和層析),應(yīng)用本室已成功研制的包涵體洗滌方法進行洗滌,包涵體經(jīng)過洗滌后用8M尿素溶解進行鎳柱親和層析純化,通過尿素梯度透析復(fù)性后得到融合蛋白,進行SDS-PAGE鑒定結(jié)果,并分析復(fù)性后蛋白的純度和濃度。
5.干擾素抗病毒增殖實驗和腫瘤細胞錨定實驗
將復(fù)性的SA-hIFN-α2a融合蛋白采用微量細胞病變抑制法通過A549/VSV系統(tǒng)測定SA-hIFN-α2a的抗病毒增活性;應(yīng)用流式細胞儀檢
5、測SA-hIFN-α2a融合蛋白對膀胱癌細胞MB49細胞的錨定率,初步評價經(jīng)純化復(fù)性后SA-hIFN-α2a融合蛋白的體外活性。
結(jié)果:
1.誘導(dǎo)表達SA-hIFN-α,2a融合蛋白
將質(zhì)粒pET24a-SA-L-hIFN-α2a導(dǎo)入大腸桿菌中后,在帶有氯霉素和卡鈉霉素抗性的平板中經(jīng)過37℃、16-48h孵育后生長出單克隆菌落,并使菌落過夜活化后37℃、220rpm、0.5mmol/LIPTG條
6、件下誘導(dǎo)表達。經(jīng)SDS-PAGE鑒定目的蛋白出現(xiàn)在約33KD的位置,經(jīng)BandScan軟件分析,SA-hIFN-α2a目的蛋白約占總蛋白的15%。表達菌通過高壓破碎后,SDS-PAGE顯示目的蛋白主要以包涵體的形式存在于沉淀中。
2.融合蛋白SA-hIFN-α2aIPTG誘導(dǎo)條件的優(yōu)化
經(jīng)過SDS-PAGE鑒定,IPTG誘導(dǎo)時間在4h誘導(dǎo)終濃度為0.5mmol/L時為最佳誘導(dǎo)條件。
3.West
7、ernBloting鑒定SA-hIFN-α2a融合蛋白的表達
將菌體重懸于PBS緩沖液,高壓破碎1次(1000MPa),可達到很好的破菌效果。經(jīng)洗滌液洗后的包涵體用8M尿素溶解后經(jīng)過鎳柱親和層析進行分離純化,目的蛋白被100mmol/L濃度咪唑洗出。經(jīng)尿素梯度透析復(fù)性,復(fù)性后的目的條帶經(jīng)SDS-PAGE鑒定融合蛋白的非還原狀態(tài)主要以多聚體的形式存在,經(jīng)BandScan軟件分析純度為97%,采用Bradford法測定蛋白濃度
8、為288.96μg/ml。
5.干擾素抗病毒增殖實驗和腫瘤細胞錨定實驗
通過A549NSV系統(tǒng)鑒定了重組SA-hIFN-α2a融合蛋白對接毒的A549細胞有很好的保護作用,對VSV有明顯的抑制效果。我們采用微量細胞病變抑制法,通過A549/VSV系統(tǒng)對重組的SA-hIFN-α2a融合蛋白進行了體外活性測定,其效價約為6.14×107IU/mg;流式細胞儀檢測SA-hIFN-α2a融合蛋白對經(jīng)生物素化的MB49
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