HPS自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的免疫原性及其與宿主細(xì)胞相互作用研究.pdf

1、副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis)作為豬上呼吸道的一種常在菌，在特定條件下可以侵入機(jī)體引起全身性疾病。近年來，該病給全球養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，同時(shí)也引起了研究者的關(guān)注。目前，雖然有大量針對(duì)副豬嗜血桿菌的研究報(bào)道，尋找出許多毒力候選基因，但我們對(duì)副豬嗜血桿菌致病機(jī)制的了解還十分有限。
　　 革蘭氏陰性細(xì)菌Ⅴ型蛋白分泌系統(tǒng)，也稱為自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。該蛋白主要由3部分組成，包括信號(hào)肽，N端的passenger結(jié)構(gòu)域(

2、passenger domain)和C端的β結(jié)構(gòu)域(βdomain)，其中passenger結(jié)構(gòu)域是其發(fā)揮功能的部分。研究表明，該蛋白與細(xì)菌的粘附、入侵、細(xì)胞毒性有關(guān)，可介導(dǎo)生物被膜的形成和血清抗性的產(chǎn)生，因此被認(rèn)為是病原微生物的一種重要的毒力因子。
　　 為探究自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在副豬嗜血桿菌的致病過程中可能起到的作用，本論文將副豬嗜血桿菌SH0165菌株中發(fā)現(xiàn)的兩個(gè)自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因at2和at3作為研究對(duì)象，運(yùn)用PCR、原核表達(dá)、單克

3、隆抗體、蛋白免疫印跡等技術(shù)開展研究。主要研究結(jié)果如下：
　　 1．a(chǎn)t2、 at3、 at2-passenger domain(at2-pd和at3-passenger domain(at3-pd)的克及相應(yīng)蛋白的原核表達(dá)
　　 以SH0165菌株的基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增at2、at3、at2-pd和at3-pd，四個(gè)片段大小分別為2336bp、2443bp、1368bp和1392bp，分別編碼771、780、4

4、50和458個(gè)氨基酸。將at2、at3分別與pET-30a連接，at2-pd、at3-pd分別與pET-28a連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli/DH5α菌株，將測(cè)序正確的質(zhì)粒再轉(zhuǎn)化E.coli/BL21(DE3)菌株并進(jìn)行原核表達(dá)。結(jié)果成功克隆了上述4個(gè)片段并構(gòu)建了其相應(yīng)的原核表達(dá)載體，在E.coli/BL21(DE3)菌株中實(shí)現(xiàn)了上述4種蛋白的原核表達(dá)，分別命名為AT2、AT3、AT2-PD和AT3-PD。
　　 2．AT2-P

5、D和AT3-PD蛋白的純化及其單克隆抗體的制備
　　 在E.coli/BL21(DE3)菌株中表達(dá)的AT2-PD和AT3-PD蛋白以可溶性的形式存在，利用蛋白融合表達(dá)的組氨酸標(biāo)簽對(duì)蛋白進(jìn)行純化。使用純化的蛋白免疫BALB/c鼠進(jìn)行單克隆抗體的制備工作。結(jié)果AT2-PD蛋白獲得5株能產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為1E4、3C9、3D8、3E8和4B10； AT3-PD蛋白獲得5株能產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為

6、2E6、3H8、4C8、4F12和4H10。間接ELISA和Western-blot分析表明抗體特異性良好，其中4B10的效價(jià)為1:102400；4H10的效價(jià)為1:25600，這兩份單克隆抗體用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的開展。
　　 3．AT2和AT3蛋白在E.coli/BL21(DE3)和SH0165上的定位分析
　　 利用獲得的單克隆抗體結(jié)合Western-blot實(shí)驗(yàn)分析AT2和AT3蛋白分別在E.coli/BL21(DE3)

7、-AT和SH0165上的定位情況。分別提取這兩種細(xì)菌的細(xì)胞總蛋白，細(xì)胞膜總蛋白和分泌蛋白。結(jié)果顯示，AT2和AT3蛋白分別存在于表達(dá)該蛋白的E.coli/BL21(DE3)菌株的細(xì)胞總蛋白，細(xì)胞膜總蛋白和分泌蛋白中；AT2蛋白存在于SH0165的細(xì)胞總蛋白和細(xì)胞膜總蛋白中；AT3蛋白存在于SH0165的細(xì)胞總蛋白、細(xì)胞膜總蛋白和分泌蛋白中。
　　 4．AT2和AT3蛋白的免疫原性分析
　　 由于AT2和AT3蛋白在SH0

8、165是細(xì)胞膜蛋白和/或分泌蛋白，故對(duì)其免疫原性進(jìn)行分析。首先檢測(cè)其在15株HPS標(biāo)準(zhǔn)血清型菌株中的分布情況，實(shí)驗(yàn)表明at2基因除在標(biāo)準(zhǔn)血清型4型菌株中未擴(kuò)增出相應(yīng)條帶外，其余均可擴(kuò)增出相應(yīng)條帶；at3基因在所有標(biāo)準(zhǔn)血清型菌株中均可擴(kuò)增出相應(yīng)條帶。利用純化的AT2-PD和AT3-PD蛋白作為抗原包被酶標(biāo)板，使用7份不同血清型菌株攻毒豬后獲得的感染血清進(jìn)行間接ELISA實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示為陽(yáng)性；同時(shí)利用Western-blot對(duì)該7份血清中針

9、對(duì)AT2-PD和AT3-PD的抗體也進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果也顯示為陽(yáng)性。
　　 5．AT2和AT3蛋白分別與細(xì)胞相互作用
　　 使用分別表達(dá)AT2和AT3蛋白的E.coli/BL21(DE3)菌株分別與豬髖動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞、豬肺細(xì)胞、豬氣管上皮原代細(xì)胞進(jìn)行粘附與粘附阻遏實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示這兩種細(xì)菌與上述3種細(xì)胞均無(wú)明顯的粘附作用。分別使用純化的AT2-PD和AT3-PD蛋白與上述3種細(xì)胞進(jìn)行結(jié)合實(shí)驗(yàn)，通過間接免疫熒光觀察，表明這兩種蛋