農(nóng)藥特異性基因工程抗體的分子設(shè)計、表達(dá)及識別機制.pdf

1、為研制農(nóng)藥特異性基因工程抗體，本研究以有機磷殺蟲劑三唑磷和對硫磷為目標(biāo)分析物，采用一種新型水溶性免疫佐劑（快速佐劑）進(jìn)行了三唑磷和對硫磷單克隆抗體（單抗）的制備。該免疫佐劑操作簡便，無需乳化，與人工抗原混合后可直接對Balb/c小鼠進(jìn)行小腿肌肉注射，免疫脾細(xì)胞制備方便，細(xì)胞融合后篩選得到有效細(xì)胞株的陽性率超過30％;間接競爭酶聯(lián)免疫吸附法(ic-ELISA)篩選獲得能夠穩(wěn)定分泌高親合力、高特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞株，快速制備了針對農(nóng)藥三唑

2、磷和對硫磷的高親合力單抗，靈敏度和特異性等方面與以往采用弗氏佐劑獲得的單抗相當(dāng)，對三唑磷的識別靈敏度(IC50)0.91ng/mL，對對硫磷識別靈敏度(IC50)8.18ng/mL。
　　以制備的雜交瘤細(xì)胞株為RNA來源，采用抗體亞型特異性的簡并性引物，通過RT-PCR法擴增了抗對硫磷單抗的γ1亞型重鏈可變區(qū)(VH)和κ亞型輕鏈可變區(qū)(VL)的基因序列，以及抗三唑磷單抗的γ1亞型VH和稀有的λ亞型VL基因序列，通過重疊延伸PCR法

3、成功將相應(yīng)的VH、VL核苷酸序列經(jīng)連接肽(Gly4Ser)3串聯(lián)，構(gòu)建了VH-VL連接方式的單鏈抗體(scFv)全長序列。將抗三唑磷scFv和抗對硫磷scFv的全長序列依次構(gòu)建到大腸桿菌原核表達(dá)體系、桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)、畢赤酵母真核表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行可溶性表達(dá)，免疫印跡法鑒定蛋白表達(dá)，ic-ELISA法評價抗體活性。結(jié)果表明，抗三唑磷抗體和抗對硫磷抗體的VH和VL基因序列被成功擴增，在畢赤酵母表達(dá)體系中更經(jīng)濟有效地獲得了高活性的抗三

4、唑磷scFv和抗對硫磷scFv，抗體活性與親本單抗相當(dāng)，為進(jìn)一步展開新型抗體的分子設(shè)計奠定了研究基礎(chǔ)。
　　在明確表達(dá)體系的基礎(chǔ)上，研究了輕重鏈可變區(qū)取向(VH-VL、VL-VH)對抗三唑磷scFv、抗對硫磷scFv的生物活性和表達(dá)水平的影響。結(jié)果表明，輕重鏈可變區(qū)不同取向?qū)谷蛄譻cFv和抗對硫磷scFv的親合力和特異性沒有明顯影響，產(chǎn)物具備特異性識別相應(yīng)靶標(biāo)化合物的能力，對三唑磷的IC50在0.4～0.5ng/mL，對對硫磷

5、IC50在8.5～10.5ng/mL，抗體活性與親本單抗相當(dāng);相較而言，抗三唑磷scFv和抗對硫磷scFv在VL-VH取向下，更容易獲得較高水平的蛋白表達(dá)，表達(dá)量均達(dá)700mg/L左右。隨后，嘗試了兩個抗三唑磷scFv的串聯(lián)，設(shè)計了不同輕重鏈可變區(qū)取向和連接肽長度的抗三唑磷雙價串聯(lián)單鏈抗體，ic-ELISA法鑒定不同抗體的活性。結(jié)果表明，抗三唑磷雙價串聯(lián)單鏈抗體的抗體活性與連接肽長短[Gly4Ser、(Gly4Ser)3]、單價scFv

6、的表達(dá)情況無關(guān)，與輕重鏈取向有關(guān)，輕鏈在N端的構(gòu)建方式更易獲得高識別能力的抗體蛋白，親合力（IC50在0.8～0.9ng/mL）和特異性與親本單抗相當(dāng)。在上述研究基礎(chǔ)上，設(shè)計了不同連接方式的三唑磷-對硫磷雙特異性串聯(lián)單鏈抗體。ic-ELISA法鑒定結(jié)果表明，輕重鏈可變區(qū)取向同樣是影響三唑磷及對硫磷雙特異性串聯(lián)單鏈抗體識別能力的重要因素。其中，以VLT-VHT-Gly4Ser-VLP-VHP的構(gòu)建方式更容易獲得高識別能力的抗體，但對三唑磷

7、和對硫磷的靈敏度均下降了近7倍，同時交叉識別譜發(fā)生了改變。綜上所述，在構(gòu)建高親合力單鏈抗體、雙價串聯(lián)單鏈抗體以及雙特異性串聯(lián)單鏈抗體時，應(yīng)優(yōu)先考慮輕鏈可變區(qū)在N端的構(gòu)建方式;在設(shè)計雙特異性串聯(lián)單鏈抗體時，還需要考慮兩個scFv可變區(qū)片段之間的相互干擾導(dǎo)致抗體活性下降和非特異性結(jié)合的問題。
　　最后，利用Accelrys公司的Discovery studioTM，根據(jù)抗體的氨基酸序列進(jìn)行同源模建，構(gòu)建了抗三唑磷單鏈抗體和抗對硫磷單鏈