HIF-1α基因轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療缺血性心臟病的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、缺血性心臟病(IHD)是由于冠狀動(dòng)脈循環(huán)改變引起冠狀血流和心肌需求之間不平衡而導(dǎo)致的心肌損害，其發(fā)病率高，死亡率高，嚴(yán)重危害著人類的身體健康。 IHD的主要病理改變是不可逆性功能心肌細(xì)胞丟失，梗死區(qū)被纖維疤痕替代，以及殘余心肌發(fā)生心室重構(gòu)，進(jìn)而發(fā)展為充血性心力衰竭。目前的藥物治療、介入治療及冠脈旁路手術(shù)能夠改善心肌缺血，但仍然不能逆轉(zhuǎn)已經(jīng)壞死的心肌，更不能促進(jìn)心肌細(xì)胞的再生。治療性血管發(fā)生根據(jù)血管生成的機(jī)制，用人工干預(yù)的手段刺激

2、心肌缺血區(qū)小血管生長和側(cè)支循環(huán)形成，從而修復(fù)與再生壞死心肌細(xì)胞，阻止或延緩心室重構(gòu)和心功能衰竭，是當(dāng)前治療缺血性心肌病的研究熱點(diǎn)。目前治療性血管發(fā)生可通過三種方法得以實(shí)現(xiàn)：生長因子蛋白治療，細(xì)胞移植以及基因治療。 缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)是細(xì)胞在缺氧條件下產(chǎn)生的具有轉(zhuǎn)錄活性的核蛋白，不僅可以結(jié)合多種促血管因子如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)等及其受體基因啟動(dòng)子上的缺氧反應(yīng)元件，從而增強(qiáng)相應(yīng)蛋

3、白的表達(dá)，啟動(dòng)血管新生過程，提高血流灌注，挽救瀕死缺氧的心肌細(xì)胞，還可以提高缺血心肌對(duì)缺氧環(huán)境的適應(yīng)性，增強(qiáng)酵解過程，為心肌提供更多的能量代謝，可以設(shè)想，HIF-1α用于基因治療具有兩大優(yōu)勢(shì)：1.作為上游調(diào)控基因?qū)⒈萔EGF、ANG-2等單純基因治療更具效率；2.HIF-1α在常氧條件下迅速降解，具有可控性，減低了VEGF持續(xù)高表達(dá)誘發(fā)血管瘤的危險(xiǎn)性。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)具有分化為心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞的多向分化潛能，且分離方便、增

4、殖容易、遺傳穩(wěn)定、無免疫排斥和倫理障礙等優(yōu)勢(shì)，是干細(xì)胞治療的理想供體細(xì)胞。由此，假設(shè)將轉(zhuǎn)染HIF-1α基因的MSCs移植到心梗區(qū)，以求基因和細(xì)胞治療相互協(xié)同、相互促進(jìn)，能同時(shí)、更好地實(shí)現(xiàn)心肌再生和血管發(fā)生，是一種極具潛能的替代療法。因此，本研究擬在大鼠的心肌缺血的模型上，通過移植體外轉(zhuǎn)染HIF-1α基因的MSCs，探求這種方法對(duì)IHD的治療效果，為進(jìn)一步的臨床應(yīng)用提供鋪墊性實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)共分為三部分： 第一部分HIF-1α基因

5、克隆及HIF-1α-pcDNA3.1載體的構(gòu)建 目的：構(gòu)建并鑒定HIF-1α真核表達(dá)載體HIF-1α-pcDNA3.1。 方法：抽提大鼠心肌細(xì)胞mRNA，以mRNA為模版，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，PCR擴(kuò)增HIF-lα目的基因，連接到pGEM-T載體中，酶切，測(cè)序證實(shí)，雙酶切將HIF-1α轉(zhuǎn)至pcDNA3.1中。 結(jié)果：瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示RT-PCR擴(kuò)增出的特異片段約2480bp，基因測(cè)序結(jié)果與GenBank報(bào)道

6、的完全一致，成功構(gòu)建了HIF-1α-pcDNA3.1真核表達(dá)載體。 第二部分HIF-1α基因轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及其表達(dá) 目的：研究HIF-1α真核表達(dá)載體HIF-1α-pcDNA3.1體外轉(zhuǎn)染MSCs及HIF-1α基因在MSCs中的表達(dá)情況。 方法：采用密度梯度離心-貼壁培養(yǎng)法獲Wistar大鼠MSCs。對(duì)其進(jìn)行表型及生長曲線測(cè)定，并進(jìn)行向成骨細(xì)胞及脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化的研究。采用脂質(zhì)體介導(dǎo)技術(shù)將HIF-1α-pc

7、DNA3.1轉(zhuǎn)染至MSCs，在倒置顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染后細(xì)胞形態(tài)和生長情況的變化，通過RT-PCR，Western和ELISA鑒定HIF-1α在細(xì)胞中的表達(dá)情況。 結(jié)果： 1.采用Pcrcoll密度梯度離心-貼壁培養(yǎng)法易獲取大鼠MSCs，形態(tài)學(xué)觀察呈纖維樣細(xì)胞外觀；免疫組化檢測(cè)結(jié)果為CD44、SH3(CD73)陽性，CD34、CD45陰性，符合MSCs表面標(biāo)記；流式細(xì)胞儀分析，CD44、SH3(CD73)陽性細(xì)胞分別占94.

8、7％、97.3％，表明分離培養(yǎng)的MSCs純度較高；經(jīng)誘導(dǎo)后，所培養(yǎng)的MSCs可成功向成骨細(xì)胞及脂肪細(xì)胞分化。 2.RT-PCR證實(shí)采用陽離子脂質(zhì)體Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染的MSCs表達(dá)HIF-1α mRNA明顯增加，Westem和。ELISA檢測(cè)證實(shí)轉(zhuǎn)基因MSCs表達(dá)HIF-1α蛋白明顯增加。 第三部分HIF-1α轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)大鼠心功能的影響 目的：利用冠脈結(jié)扎法構(gòu)建Wistar大鼠心

9、肌缺血?jiǎng)游锬Ｐ停接慔IF-1α基因轉(zhuǎn)染MSCs后心肌移植對(duì)缺血性心臟病心功能及心室重構(gòu)的影響，并比較聯(lián)合治療與基因治療、細(xì)胞治療的療效差別。 方法：80只Wistar近交系大鼠隨機(jī)分為5組(各組16只)，首先結(jié)扎前降支，2周后形成慢性心肌缺血?jiǎng)游锬Ｐ?。A組于心梗區(qū)移植轉(zhuǎn)HIF-1α的MSCs(聯(lián)合組)，B組單純移植等量的MSCs(細(xì)胞組)，C組單純注射HIF-1α-pcDNA3.1復(fù)合物(基因組)，D組注射無血清培養(yǎng)液(對(duì)照組

10、)，E組僅用于模型評(píng)估(評(píng)估組)。另取16只未結(jié)扎冠脈的Wistar近交系大鼠為假手術(shù)組，亦未作任何治療，設(shè)為F組。移植4周后以Buxco系統(tǒng)檢測(cè)心功能，測(cè)量心梗面積，免疫組化檢測(cè)Brdu、肌鈣蛋白T雙染確定移植細(xì)胞的存活與分化，通過Ⅷ因子染色檢測(cè)血管新生，通過RT-PCR檢測(cè)HIF-1α基因的體內(nèi)表達(dá)。 結(jié)果：冠脈結(jié)扎法制作的大鼠心梗模型，其有效使用率為78.4％(80/102)。移植治療4周后，聯(lián)合組心梗面積小于細(xì)胞組與基因

11、組的心梗面積；Buxco檢測(cè)心功能顯示LVSP、+dp/dtmax明顯高于其他各組，INEDP、-dp/dtmax明顯低于其他各組；Ⅷ因子染色示聯(lián)合組動(dòng)物心梗區(qū)毛細(xì)血管密度高于細(xì)胞組和對(duì)照組，較基因組也有一定程度增加；Brdu、肌鈣蛋白T雙染示各治療組心梗區(qū)心肌細(xì)胞數(shù)量不同程度多于對(duì)照組，部分為雙染陽性細(xì)胞；RT-PCR顯示聯(lián)合組HIF-1α的體內(nèi)表達(dá)高于其他各組。 結(jié)論： 1.成功構(gòu)建了HIF-1α-pcDNA3.1真