弱精子癥患者精子中CRISP2基因及其蛋白產物的初步研究.pdf

1、不孕不育是全世界關注的研究課題。目前,不孕不育的發(fā)病率有逐年上升的趨勢。有統計研究表明在不孕不育中夫婦中由男方因素導致的已上升到了50％[1]。而近來有研究顯示,在因不孕不育而就診的夫婦中,由于男性因素所導致的不育提高到了2/3。
　　 對于由男性因素所導致的不育的臨床研究表明,男性精子活力低下是其主要的因素之一,臨床稱之為弱精子癥。臨床導致弱精子癥病因眾多,其中包括感染、精液液化異常、免疫因素、內分泌因素、Kartagener

2、’s綜合征、染色體異常、精索靜脈曲張以及微量元素缺乏和不良生活習慣等因素。正是由于弱精癥病因眾多,發(fā)病機制尚不明確,所以臨床無法采取有效的、針對性的治療措施,其治療效果也不令人滿意,很多不孕不育夫婦最終只能選擇人工輔助生殖。有研究發(fā)現,在一份正常的精液樣本中,在低活力精子中一些基因的表達明顯低于高活力精子。一些基因(如Tektin-2、DNAI1、DNAH5、DNAH11)[2]也已被證實與弱精子癥的發(fā)生有關。上述這些研究表明精子中某些

3、基因mRNA的表達水平的差異是與弱精子癥發(fā)生、發(fā)展是密切相關的。為了能更好的揭示這一現象,前期我們采用基因芯片技術對弱精子癥基因表達譜進行了研究,并從中篩選獲得部分弱精子癥差異表達基因。按照基因表達上調或下調2倍以上并且兩組樣本t檢驗p<0.05的篩選標準,在含有41000個基因的芯片中,芯片檢測數據經GeneSpring10.0表達譜分析軟件分析,共獲得1265個弱精子癥特異表達基因,其中307個基因在弱精子癥組中表達上調,958個基

4、因在弱精子癥組中表達下調(Log2Ratio≤1或Log2Ratioi≥1 P<0.05)。但基因芯片作為一種高效、大規(guī)模地獲取生物信息的技術,其所篩選所產生的海量數據中勢必存在部分假陽性。而生物信息學作為近些年崛起的一門通過綜合利用生物學、計算機科學和信息技術的新興學科,它為從海量數據中去偽存真進行挖掘數據提供了一種有效手段。本研究利用生物信息學工具對前期芯片篩查結果進行深入挖掘,從中發(fā)掘出與弱精子癥相關基因,并對其進行深入研究,闡述

5、其與成年男性弱精子癥發(fā)生、發(fā)展的關系。本研究的主要研究方法、內容和結論包括以下幾個方面:
　　 第1部分基于生物信息學弱精子癥相關基因挖掘
　　 目的:
　　 運用多種生物信息學工具對前期基因芯片篩查所得弱精子癥差異表達基因(共獲得的1265個弱精子癥特異表達基因,其中307個基因在弱精子癥實驗組中表達上調,958個基因在弱精子癥實驗組中表達下調)進行深入發(fā)掘,從中篩選出與弱精子癥密切相關的弱精子癥特異表達基因,

6、并對其生物學功能以及與弱精子癥發(fā)生、發(fā)展關系進行深入研究。
　　 方法:
　　 1.將前期基因芯片檢測數據經GeneSpring10.0表達譜分析軟件分析所得的1265個弱精子癥特異表達基因,其中307個基因在弱精子癥實驗組中表達上調,958個基因在弱精子癥實驗組中表達下調(Log2Ratio≤1或Log2Ratio≥1 P<0.05)。分別導入在線分析軟件GATHER、PANTHER以及ToppGene。
　　

7、 2.運用上述生物信息學軟件對上述差異基因進行生物信息學分析挖掘,對其功能進行功能分析以及信號轉導通路分析。
　　 結果:
　　 1.差異基因GATHER分析將弱精子癥特異表達基因上傳導入GATHER在線軟件進行分析,軟件共計可識別基因1205個。對差異基因進行GO分類分析發(fā)現,差異基因主要與細胞生理過程和物質新陳代謝有關,如G蛋白偶聯的信號轉導通路、細胞蛋白質/大分子物質新陳代謝有關；
　　 2.差異基因PAN

8、THER分析將弱精子癥特異表達基因導入PANTHER在線分析軟件,共計有932個基因可被識別,通過軟件分析結果發(fā)現,可被識別的差異基因pathway分析發(fā)現在整合素信號轉導通路、白介素信號轉導通路、過氧化應激反應、TGF—β信號轉導通路以及凋亡信號轉導通路是上調的,而在腎上腺素/去甲腎上腺素合成、5-羥色胺合成、bZIP轉錄因子轉錄調節(jié)、組胺合成通路是下調的。
　　 3.ToppGene分析分別將在弱精子癥中上調表達差異基因30

9、7個、下調表達差異基因958個上傳導入ToppGene進行在線功能分析。上調基因中共有234個可被識別,下調基因中共有663個可被識別。經過軟件對差異基因參與生物學分析發(fā)現,在弱精子癥中上調表達的差異基因主要與細胞免疫應答、抗原識別與呈遞、細胞死亡、凋亡以及介導細胞程序化死亡有關。而下調表達基因則主要與蛋白水解、細胞蛋白質大分子物質代謝、修飾相關的蛋白質及大分子物質代謝、蛋白K48泛素化過程以及微管細胞骨架構成有關。
　　 結論

10、:
　　 1.通過生物信息學挖掘發(fā)現弱精子癥精子在活力下降的同時,精子的基本生命活動也下降,同時更易于發(fā)生凋亡、死亡。
　　 2.參與細胞骨架構成、微管運動、細胞運動的一些差異表達基因,如KIF3B、MYO15A、KIF6、KIF26B、KIF3A、DNHD2、DMN、DYNC2H1、STARD9、MYOHD1、TPM1等,可能與弱精子癥相關,值得進一步深入研究。
　　 3.結合文獻挖掘發(fā)現CRISP2基因及其表

11、達產物與弱精子癥密切相關,值得進一步深入研究
　　 第2部分弱精子癥患者精子中CRISP2基因及蛋白初步研究
　　 目的:
　　 結合前期芯片篩查、生物信息學工具挖掘以及文獻挖掘,發(fā)現CRISP2基因及其蛋白質表達產物與弱精子癥密切相關。通過實驗探討弱精子癥患者精子中CRISP2基因(富含半胱氨酸的分泌蛋白2)mRNA及蛋白的表達水平,探討其與精子活力的關系及相關的分子機制。
　　 方法:
　　

12、1.收集成年男性弱精子癥患者精液77例,活力正常精液67例作為對照組。采用50％Percoll離心分離純化后,-80℃保存；
　　 2.將收集的精子標本從-80℃冰箱中取出,37℃水浴箱解凍,每四份合為一份,采用RNeasy mini kit提取精子RNA。采用轉錄酶-聚合酶鏈式反應(RealTime-PCR),SYBR Green熒光實時定量PCR技術檢測CRISP2 mRNA表達量；
　　 3.凍存標本解凍后,采用總

13、蛋白提取試劑盒提取總蛋白,免疫印跡(WesternBlot)檢測蛋白相對表達量。
　　 4.CRISP2蛋白STRING分析,將CRISP2蛋白名上傳至STRING數據庫(網址http://string-db.org/),對與CRISP2蛋白相關蛋白及其之間相互作用進行分析。
　　 5.進一步結合文獻挖掘對CRISP2基因及其蛋白表達產物進行深入研究。
　　 結果:
　　 1.CRISP2基因在弱精子癥患

14、者精子中的表達量明顯低于其在正常對照組精子中的表達量,下調達4.3倍；
　　 2.Western Bbt發(fā)現CRISP2蛋白在弱精子癥組較正常對照組下調約1.71倍,兩組之間的表達量有明顯的統計學差異(P<0.05)。
　　 3.STRING分析提示CRISP2蛋白與GRSF1、GGN、TPX2、SPATA22、MAP3K11、NSUN4、PGK2、SPZ1、LDHC、LUZP4等蛋白存在相互作用。
　　 結論:

15、
　　 1.CRISP2基因除通過Wnt信號轉導通路參與精子發(fā)育調節(jié),還通過RyR受體信號轉導通路,影響精子Ca2+通道的活性,其蛋白類表達產物直接參與精子尾部重要細胞骨架結構構。
　　 2.CRISP2基因以及蛋白的表達水平與精子活力密切關系。弱精子癥患者精子中CRISP2基因mRNAs及蛋白表達下調可能與精子活力下降有密切的聯系。
　　 3.提示CRISP2基因及蛋白可能會成為潛在的診斷標記物,這一基因的進一