COUP-TF I對雄烯銅合成影響的分子機理研究.pdf

1、雄烯酮是由睪丸生成的一種甾體化合物，是引起公豬膻味的化合物之一。它的沉積水平取決于其在豬體內的合成和代謝水平，并由多個基因參與調控。目前的研究發(fā)現，CYP11A1、CYP17和StAR是雄烯酮合成的主要基因。而COUP-TFⅠ是與雄烯酮合成和代謝基因有關的轉錄因子。COUP-TFⅠ已經被證實在小鼠、牛和人腎上腺皮質細胞中是CYP17基因轉錄的負調控蛋白，同時，它可抑制StAR的表達而抑制載體化合物的形成。但卻沒有相關的研究表明COUP-

2、TFⅠ與豬睪丸中雄烯酮合成分子機理相關的CYP11A1、CYP17A1、StAR基因之間存在直接的關系。本研究擬使用細胞培養(yǎng)，真核表達載體構建與瞬時轉染等方法，利用qRT-PCR、ELISA等分析手段，探究COUP-TFⅠ與豬睪丸中雄烯酮合成途徑中CYP11A1、CYP17A1和StAR之間的關系，從而闡明COUP-TFⅠ對雄烯酮合成影響的分子機理，為改善公豬膻味，選育優(yōu)良公豬提供理論依據。
　　 不同品種及不同月齡階段的豬睪丸

3、及其睪丸間質細胞的生理功能有所不同。有研究表明，低月齡階段公豬的雄烯酮水平低于高月齡階段的雄烯酮水平。本實驗選取幼年期1月齡和成年期6月齡的巴馬香豬睪丸，主要從兩個方面進行了研究:
　　 (1)以β-actin作為內參基因，利用qRT-PCR分析不同月齡階段中COUP-TFⅠ、CYP11A1、CYP17A1和StAR基因的相對表達量，利用ELISA方法測定睪丸組織中雄烯酮的水平;
　　 (2)利用不過篩培養(yǎng)法對1月齡和6

4、月齡的巴馬香豬睪丸間質細胞進行體外培養(yǎng)，構建含有篩選基因neo的COUP-TFⅠ真核表達載體COUP-TFⅠ-neo，并將此重組質粒通過瞬時轉染的方法轉入1月齡和6月齡的豬睪丸間質細胞，同時以轉染pEGFP-C1質粒和未轉染的細胞作對照。利用qRT-PCR分析轉染后細胞中COUP-TFⅠ、CYP11A1、CYP17A1和StAR的相對表達量的變化，利用ELISA檢測轉染后細胞中雄烯酮水平的變化。
　　 通過以上實驗，得到了如下結

5、果:
　　 (1) COUP-TFⅠ、CYP11A1、CYP17A1和StAR在1月齡和6月齡的睪丸組織中均有表達。6月齡睪丸組織中COUP-TFⅠ、CYP17A1和StAR的相對表達量與1月齡相比，差異極顯著(P＜0.01)，而CYP11A1差異顯著(P＜0.05)?？傮w上來看，6月齡睪丸組織中的這四個基因的表達量高于1月齡睪丸組織相應的基因表達量;1月齡和6月齡睪丸組織中雄烯酮含量分別為1.6583+0.0133 ng/mL

6、和3.3812+0.0214 ng/mL。
　　 (2)構建了COUP-TFⅠ-neo重組質粒，并將其轉入了1月齡和6月齡的巴馬香豬睪丸間質細胞。qRT-PCR結果顯示:在轉入COUP-TFⅠ-neo重組質粒后，1月齡和6月齡細胞中的CYP11A1、CYP17A1和StAR的相對表達量都出現了降低。并且1月齡和6月齡細胞中CYP11A1、CYP17A1和StAR的相對表達量與相應的空白對照和轉染pEGFP-C1的陰性對照組相比，

7、差異都為極顯著(P＜0.01)。對比未進行轉染和轉染COUP-TFⅠ-neo重組質粒后的1月齡和6月齡細胞，6月齡細胞中COUP-TFⅠ、CYP11A1、CYP17A1的相對表達量與1月齡的相比，差異都極顯著(P＜0.01)，而StAR的相對表達量差異都顯著(P＜0.05);且未進行轉染的6月齡細胞中CYP11A1、CYP17A1和StAR的相對表達量高于1月齡細胞，轉染COUP-TFⅠ-neo重組質粒后的6月齡細胞中CYP11A1、C

8、YP17Al和StAR的相對表達量低于1月齡細胞。通過ELISA檢測發(fā)現，轉染COUP-TFⅠ-neo重組質粒的6月齡細胞的雄烯酮水平與空白對照和轉染pEGFP-C1的陰性對照組相比，差異極顯著(P＜0.01);轉染COUP-TFⅠ-neo重組質粒的1月齡細胞的雄烯酮水平與空白對照和轉染pEGFP-C1的陰性對照組相比，差異顯著(P＜0.05)。
　　 根據實驗結果，得出了如下結論:
　　 (1) COUP-TFⅠ、CY

9、P11A1、CYP17A1和StAR在1月齡和6月齡的睪丸組織中均有表達，6月齡睪丸組織中這些基因的相對表達量以及雄烯酮水平都高于1月齡的睪丸組織。睪丸組織中CYP11A1、CYP17A1和StAR的表達量與雄烯酮水平正相關;
　　 (2)上調COUP-TFⅠ的表達可以顯著抑制CYP11A1、CYP17A1和StAR的表達以及雄烯酮的水平的產生，且COUP-TFⅠ對6月齡細胞中CYP11A1、CYP17A1和StAR基因以及雄烯