華中地區(qū)高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒的分子進(jìn)化特征研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的一種以妊娠母豬嚴(yán)重繁殖障礙以及仔豬的呼吸道癥狀和高死亡率為特征的傳染病。該病最早于1987年報(bào)道于美國(guó)南部,現(xiàn)已遍及世界各地,給全球養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
　　 2006年,我國(guó)暴發(fā)了一種以高熱、高發(fā)病率和高死亡率為特征的“豬高熱綜合癥”。通過(guò)國(guó)內(nèi)學(xué)者的大量研究,證實(shí)高致病性PRRSV變異株是“豬高熱綜合癥”的主要病原。針對(duì)這種新的PRRS,本研究

2、開(kāi)展了病毒的分離與鑒定,分析了分離毒株與國(guó)內(nèi)外代表毒株的遺傳進(jìn)化關(guān)系,建立了RT-PCR診斷方法,并對(duì)其主要免疫原性基因ORF5進(jìn)行了修飾與改造。主要研究?jī)?nèi)容包括
　　 1.高致病性PRRSV的分離、鑒定
　　 利用Marc-145細(xì)胞對(duì)“豬高熱綜合癥”期間發(fā)病豬的組織樣品進(jìn)行病毒分離,并通過(guò)RT-PCR、電鏡觀(guān)察以及間接免疫熒光等試驗(yàn)證實(shí)分離的病毒為PRRSV。對(duì)分離的毒株WUH1、HG、GD、XA進(jìn)行了本動(dòng)物回歸試驗(yàn)

3、,結(jié)果人工感染豬表現(xiàn)出與臨床上“豬高熱綜合癥”一致的臨床癥狀,感染豬發(fā)病率達(dá)100％,死亡率高達(dá)80％,從而確定分離的這四株毒株均為高致病性PRRSV。
　　 2.高致病性PRRSV WUH1株的全基因組序列分析
　　 通過(guò)RT-PCR分段擴(kuò)增并測(cè)定了PRRSV WUH1株的全基因組序列,序列分析結(jié)果表明:WUH1株屬于美洲型毒株,其基因組兩端非編碼區(qū)5’UTR和3’UTR各存在一個(gè)堿基的缺失,且Nsp2蛋白中存在30個(gè)

4、氨基酸的不連續(xù)缺失。與國(guó)內(nèi)分離的變異株JXA1的基因組同源性高達(dá)98.7％。遺傳進(jìn)化分析表明WUH1與國(guó)內(nèi)高致病性PRRSV親緣關(guān)系較近,有著共同的祖先。
　　 3.華中地區(qū)PRRSV分離株Nsp2、ORF3和ORF5基因的序列特征分析
　　 對(duì)從華中地區(qū)分離的18株P(guān)RRSV分離株的Nsp2、ORF3和ORF5基因進(jìn)行序列分析,結(jié)果表明:有17株病毒的Nsp2存在30個(gè)氨基酸的不連續(xù)缺失,缺失位置與WUH1相同,只有1

5、株未發(fā)生此缺失。根據(jù)所建立的遺傳進(jìn)化樹(shù)確定這17株分離株與高致病性PRRSV的親緣關(guān)系較近,而另外1株被確定為疫苗株。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)高致病性PRRSV ORF5基因編碼的GP5蛋白中的多處關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)都發(fā)生了突變。GP3的抗原表位中的氨基酸發(fā)生了突變。
　　 4.PRRSV變異株RT-PCR檢測(cè)方法的建立
　　 為了便于鑒別高致病性PRRSV和經(jīng)典毒株,參考經(jīng)典毒株及高致病性毒株的基因序列,在Nsp2基因缺失區(qū)的兩端保守區(qū)

6、設(shè)計(jì)并合成了一對(duì)引物,經(jīng)典毒株擴(kuò)增片段為508bp,而高致病性PRRSV擴(kuò)增片段為418bp,建立了能區(qū)分高致病性PRRSV和經(jīng)典PRRSV的RT-PCR診斷方法。試驗(yàn)證明該方法特異性良好,敏感性高。用此方法對(duì)華中地區(qū)PRRSV的流行情況進(jìn)行了調(diào)查,表明華中地區(qū)PRRSV陽(yáng)性率高達(dá)60.45％,且流行毒株主要為高致病性PRRSV變異株。
　　 5.重組毒株Em2007的全基因組及致病性分析
　　 在臨床病料檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)了N

7、sp2基因存在更多缺失的毒株,分離該毒株并命名為Em2007。全基因組序列分析發(fā)現(xiàn):Em2007的Nsp2存在連續(xù)68個(gè)氨基酸的缺失,是一種新的Nsp2缺失變異株,且其5’端非編碼區(qū)有一個(gè)堿基的缺失。進(jìn)一步的遺傳進(jìn)化分析表明,Em2007是一株潛在的自然重組毒株,全基因組存在3個(gè)同源重組區(qū)域,其親本分別為WUH1和CH-1R。通過(guò)本動(dòng)物的人工感染試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)Em2007的毒力明顯強(qiáng)于CH-1a,但較WUH1株弱。
　　 6.中國(guó)大

8、陸PRRSV的遺傳變異分析
　　 對(duì)高熱病期間分離的82株P(guān)RRSV分離株的ORF5基因進(jìn)行了序列測(cè)定和遺傳進(jìn)化分析,發(fā)現(xiàn)這些流行毒株均為美洲型毒株。同經(jīng)典的PRRSV相比,糖基化位點(diǎn)的數(shù)量明顯增多,位置也發(fā)生了變化,而且抗原性也不同于以前的疫苗株。收集了GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中1996-2008年間我國(guó)所有PRRSV分離株的全基因組序列和ORF5基因序列,從全基因組和ORF5基因兩個(gè)方面對(duì)PRRSV在我國(guó)的流行規(guī)律及遺傳進(jìn)化關(guān)系

9、進(jìn)行了綜合的分析,發(fā)現(xiàn)目前我國(guó)至少存在4種遺傳關(guān)系不同的亞群。
　　 7.人工合成的修飾型高致病性PRRSV ORF5基因的免疫原性研究
　　 為了獲得用于研制高致病性PRRSV新型疫苗的良好靶基因,針對(duì)高致病性PRRSV變異株ORF5基因的特征,將人工合成的編碼輔助性T淋巴細(xì)胞表位的核苷酸序列插入高致病性PRRSV ORF5的中和表位和誘騙表位間,將中和表位兩端的糖基化位點(diǎn)(N30、N34、N35和N51)消除,并對(duì)O