蠟梅H3組蛋白基因CpH3的克隆及功能初步分析.pdf

1、真核生物細胞核內的染色質是一切遺傳學過程的物質基礎，而組蛋白(histones)是存在于真核生物染色體內的與DNA結合的一類小分子堿性蛋白質，是染色體基本結構單位核小體的重要組成成分。組蛋白八聚體是由核心組蛋白H2A、H2B、H3和H4形成的異源二聚體。其中H3組蛋白是構成核小體的一類富含賴氨酸的組蛋白，在進化上比較保守，在植物中主要分為H3.1型和H3.2型。H3.1型組蛋白為復制依賴性組蛋白，主要在細胞的分裂期大量表達;H3.2型組

2、蛋白為非復制依賴性組蛋白，通常該類蛋白是高度乙?；?，可存在于植物的分生組織中，這兩種類型的主要區(qū)別是有無內含子的存在。組蛋白主要通過乙?；⒓谆?、磷酸化、泛素化、SUMO化等共價化學修飾作用來調節(jié)基因的表達水平。
　　 蠟梅（Chimonanthuspraecox）是蠟梅科（Calycanthaceae）蠟梅屬（Chimonanthus）落葉叢生灌木，冬季開花并且具有較強的耐寒性、耐旱性。蠟梅中組蛋白H3是否參與其高效的逆境

3、防御機制為本研究的主要目的。本實驗從已構建好的蠟梅花cDNA文庫中成功克隆得到一個組蛋白H3序列，命名為CpH3（Genebank登錄號為JQ952597）。通過對該基因在蠟梅不同組織和脅迫反應中的轉錄水平變化分析，并且構建植物超表達載體轉化煙草，分析該基因的功能。主要的研究結果有:
　　 1CpH3的分子特征
　　 通過隨機克隆測序的的方法，獲得蠟梅組蛋白H3的cDNA序列，該基因含有411bp的最大ORF，編碼136

4、個氨基酸殘基。BLAST分析表明該基因序列與其他植物組蛋白H3序列有很高的同源性，設計特異引物并以DNA為模板克隆獲得大小約為1200bp的條帶，與cDNA序列進行序列比對發(fā)現(xiàn)，該序列含有三段內含子，并且都屬于GT-AG類型內含子，推測本實驗獲得的組蛋白H3為H3.2型。進行信息學分析表明，該蛋白沒有信號肽，在細胞核內大量存在;該蛋白主要以50％的α-螺旋以及47.8％的無規(guī)則卷曲組成;并且該蛋白存在3個絲氨酸磷酸化位點、5個蘇氨酸磷酸

5、化位點。
　　 2CpH3基因的轉錄水平分析
　　 實時熒光定量分析表明CpH3基因在蠟梅成熟葉片中的表達量最高，在莖、子葉和花中的表達量次之，在根和幼葉中的表達量最低。在3輪花器官中的表達分析表明在外瓣和中瓣中的表達量較高，內瓣、雌蕊、雄蕊中表達量較低?；òl(fā)育時期的表達分析表明該基因在花發(fā)育過程中盛開期表達最高，其他時期表達量相對較低。經過非生物脅迫處理后的定量分析表明，進行高鹽脅迫15分鐘CpH3基因表達水平迅速提高

6、，一小時后該基因表達水平下降，并且遠低于對照水平，表明該基因對于蠟梅起到一定的耐鹽作用。然而該基因在受到高溫、低溫、干旱、ABA處理后，CpH3基因的表達水平遠遠低于對照，說明該基因的表達響應非生物脅迫發(fā)生變化，推測該基因可能參與了植物發(fā)育過程以及非生物脅迫的響應。
　　 3CpH3基因在煙草中的超表達
　　 本實驗成功構建了植物表達載體pCAMBIA2301g-CpH3，并轉化農桿菌GV3101。應用農桿菌介導的葉盤法