BMSCs與ALN-CS-nHA支架材料復(fù)合構(gòu)建組織工程骨的體外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、【目的】
　　1、體外進(jìn)行rBMSCs（ratbone marrow stromal cells,大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞）的分離、培養(yǎng)、鑒定；
　　2、rBMSCs與ALN/CS/nHA（新型阿倫磷酸鈉-殼聚糖-納米羥基磷灰石支架材料）共培養(yǎng)并成骨誘導(dǎo)，研究用ALN/CS/nHA與種子細(xì)胞BMSCs復(fù)合構(gòu)建組織工程骨的可行性。
　　【方法】
　　1、體外進(jìn)行分離、培養(yǎng)、鑒定rBMSCs：貼壁培養(yǎng)法分離和培養(yǎng)rBMS

2、Cs，通過FCM（Flow cytometry，流式細(xì)胞儀）鑒定rBMSCs表面抗原分子（CD73、CD90、CD105、CD34、CD45）的表達(dá)率檢測所得rBMSCs的純度；
　　2、rBMSCs復(fù)合ALN/CS/nHA體外構(gòu)建組織工程骨的實(shí)驗(yàn)研究：a、獲取p3代rBMSCs，與ALN/CS/nHA進(jìn)行體外復(fù)合培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況，MTT法進(jìn)行測定rBMSCs的增殖能力、SEM（Scanning electron

3、 microscope，掃描電鏡）下觀察細(xì)胞在材料表面的黏附情況，總體評估細(xì)胞與支架材料之間的相容性。b、rBMSCs與ALN/CS/nHA體外成骨誘導(dǎo)，于第3、7、10天檢測細(xì)胞內(nèi)ALP含量，第3、6、9、12、15天檢測上清液中Ⅰ型膠原蛋白的含量。對比分析新型材料有無促進(jìn)rBMSCs成骨作用。
　　【結(jié)果】
　　1、貼壁培養(yǎng)法成功分離、培養(yǎng)rBMSCs，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測，CD90，CD105，CD73陽性率達(dá)到95％，C

4、D34、CD45的陽性表達(dá)率在5%以下；
　　2、細(xì)胞生長特性：rBMSCs與ALN/CS/nHA復(fù)合培養(yǎng)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，三組細(xì)胞的數(shù)量逐步提高，最初3d實(shí)驗(yàn)組、對照組和空白組細(xì)胞均處于生長潛伏期，第3天后各組細(xì)胞數(shù)量明顯增加，第6天后各組細(xì)胞進(jìn)入生長平臺期，重復(fù)測量方差分析，顯示組間無差別(P>0.05)。SEM結(jié)果顯示細(xì)胞在ALN/CS/nHA表面黏附良好；3、經(jīng)成骨誘導(dǎo)后第7、14天的細(xì)胞材料復(fù)合物均有ALP(Alka

5、line phosphatas，堿性磷酸酶)、Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞ALP及Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)量總體高于對照組及空白組。重復(fù)測量方差分析，顯示組間有差別(P<0.05)。
　　【小結(jié)】
　　1、大鼠骨髓中可以分離、培養(yǎng)出體外培養(yǎng)條件下生長良好的且具有分化潛能的 rBMSCs，第3代細(xì)胞在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)下可以向成骨細(xì)胞分化；
　　2、rBMSCs可與ALN/CS/nHA良好粘附并增殖，且保持正常細(xì)胞形態(tài)。ALN/CS/