NKp44+NK細胞促類風濕關節(jié)炎成纖維樣滑膜細胞增殖的分子和信號通路機制.pdf

1、目的：
　　研究NKp44+NK細胞在RA患者外周血、滑液、滑膜組織中的表達以及其與患者臨床疾病活動度的相關性;明確NKp44+NK細胞促進RA-FLS增殖的分子機制;闡明NKp44+NK細胞通過分泌IL-22促RA-FLS增殖的信號通路。
　　方法：
　　1.研究對象
　　2012年02月至2013年12月期間，南方醫(yī)科大學附屬南方醫(yī)院中醫(yī)/風濕科和關節(jié)骨病外科門診及病房的RA患者37例（外周血標本，其中21例

2、患者同時捐贈了其膝關節(jié)滑液標本）、膝關節(jié)骨關節(jié)炎(knee osteoarthritis，KOA)患者16例（滑液標本）。
　　2.疾病分類診斷標準與病情評估
　　RA分類診斷標準，依據(jù)美國風濕病學會(ACR)1987年修訂的RA分類標準或美國風濕病學會/歐洲抗風濕病聯(lián)盟（ACR/EULAR）2010年RA新分類標準;KOA分類診斷標準，依據(jù)ACR1995年修訂的KOA分類標準。RA的病情依據(jù)DAS28和臨床疾病活動指數(shù)（c

3、linical disease activity index，CDIA）進行評估。
　　3.實驗方法
　　3.1 NKp44+NK細胞流式細胞術檢測及其臨床意義
　　應用流式細胞術分別檢測RA及其對照外周血、滑液中NKp44+NK細胞的比例，滑膜組織標本中NKp44+NK細胞采用免疫熒光法進行檢測。收集上述所納入RA患者、KOA患者以及健康對照人群的基本臨床信息。
　　3.2 NKp44+NK細胞流式分選、體外培

4、養(yǎng)以及上清細胞因子的檢測
　　應用流式細胞術分別分選RA滑液中的NK細胞及NKp44+NK細胞，并用含10％ FBS+2 mM L-谷氨酰胺+100 U/ml青霉素+100μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5％ C02細胞培養(yǎng)箱中進行體外培養(yǎng)。收集細胞上清液之前，分別給予1×細胞刺激因子（含0.081μM PMA和1.34μM ionomycin）刺激培養(yǎng)5h。NK細胞和NKp44+NK細胞上清液IL-22和M-CSF

5、采用雙抗體夾心法ELISA試劑盒進行檢測，RANKL應用MILLIPLEXTM MAP Human RANKLsingle plex試劑盒進行檢測。
　　3.3 RA-FLS體外分離培養(yǎng)和鑒定
　　應用組織塊法分離培養(yǎng)RA-FLS，當顯微鏡下滑膜細胞生長到培養(yǎng)瓶面積80％以上時，采用10％ FBS+100 U/ml青霉素+100μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，于37℃、5％ CO2細胞培養(yǎng)箱進行FLS傳代培養(yǎng)。分別采用免疫

6、組化法和流式細胞術對第4～5代的FLS進行細胞鑒定。
　　3.4 細胞體外干預分組
　?、貴LS增殖的細胞體外干預分組:50％ NKp44+NK細胞培養(yǎng)上清液組、50％NKp44+NK細胞培養(yǎng)上清液+50μg/ml IL-22拮抗劑組、50μg/ml IL-22拮抗劑組、1 ng/ml rhlL-22(recombinant human IL-22)組、10 ng/ml rhlL-22組、50 ng/mlrhlL-22組、1

7、00 ng/ml rhIL-22組、對照組（正常細胞培養(yǎng)液），同時各組均再分為24 h、48 h及72 h三個時間點的干預組。
　?、贔LS信號通路蛋白研究的細胞體外干預分組:應用50 ng/ml rhIL-22干預FLS，并干預后第0h、0.25 h、0.5 h、1h、1.5 h、2h、4h以及8h分別檢測STAT3、ERK1/2、P38總蛋白以及磷酸化蛋白的相對表達量,此外，分別用50 ng/ml rhIL-22、100μM

8、AG490、50 ng/ml rhIL-22+100μMAG490、空白對照干預FLS，除50 ng/ml rhIL-22+100μM AG490組進一步設置干預時間亞組為0.25 h、0.5 h、1h、1.5 h、2h外，其他三組干預時間均為2h，干預結束后分別采用Western Blot檢測STAT3總蛋白以及磷酸化蛋白的相對表達量(STAT3/GAPDH，p-STAT3/STAT3)。
　?、跘G490抑制FLS增殖的細胞體

9、外干預分組:50 ng/ml rhIL-22組、50 ng/mlrhIL-22+100μM AG490組、50％ NKp44+NK細胞培養(yǎng)上清液組、50％NKp44+NK細胞培養(yǎng)上清液+100μM AG490組、100μM AG490組、對照組（正常細胞培養(yǎng)液），同時各組均再分為24 h、48 h及72 h三個時間點的干預組。
　　3.5 FLS細胞增殖和信號通路蛋白的檢測
　　MTT法細胞增殖檢測:取第4～5代鑒定后的FL

10、S，分別于96孔板內(nèi)接種細胞懸液3×103 cell/孔，并細胞置于37℃、5％ CO2細胞培養(yǎng)箱中使其貼壁生長;加不同的干預措施，繼續(xù)培養(yǎng)細胞至干預結束，棄培養(yǎng)基;每孔分別加入含10％ FBS的DMEM培養(yǎng)基和終濃度為0.5mg/ml的MTT液，細胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4h后，每孔分別加入DMSO120μl，平板搖床低速振蕩10 min;酶標儀測定各孔的OD值(波長490 nm)。
　　4.統(tǒng)計學分析
　　采用SPSS20.0統(tǒng)

11、計軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料用均數(shù)±標準差(±S)描述，計數(shù)資料采用絕對數(shù)(n)及構成比(％)描述。
　　結果：
　　1.NKp44+NK細胞在RA患者不同組織中的表達及其臨床意義
　　1.1 NKp44+NK細胞在RA和對照人群外周血、滑液以及滑膜組織中的表達
　　免疫熒光檢測顯示:在RA滑膜組織中可見同時表達CD56+和NKp44+細胞表面分子的NKp44+NK細胞;然而在KOA滑膜組織中，融合處理后基本未發(fā)

12、現(xiàn)CD56+和NKp44+分子共表達的該群細胞。
　　1.2 RA外周血和滑液中NKp44+NK細胞比例與患者病情活動相關性分析
　　滑液中NKp44+NK細胞比例與DAS28評分及CDIA評分亦均呈正相關(r=0.930，p＜0.001;r=0.904，p＜0.001)。
　　2.NKp44+NK細胞通過分泌IL-22促進RA-FLS的增殖
　　2.1 RA-FLS體外培養(yǎng)與鑒定
　　RA-FLS體外培養(yǎng)

13、顯示:貼壁生長的FLS形態(tài)為長梭形，并呈“渦旋狀”優(yōu)勢生長。取第4～5代的FLS免疫組化鑒定顯示:絕大部分細胞呈現(xiàn)Vimentin(+)，同時細胞不表達CD68分子，細胞免疫組化染色呈陰性。此外，采用流式細胞術進行第4～5代FLS細胞表面分子CD55表達鑒定結果顯示:以同型對照進行設門，F(xiàn)ITC-CD55(+)細胞比例可達到99％以上。
　　2.2 NK和NKp44+NK細胞流式分選、體外培養(yǎng)及細胞上清液中細胞因子表達
　　

14、NK細胞培養(yǎng)上清表達更高濃度的RANKL(391.0±23.1 vs309.2±12.8 pg/ml; t=5.357，p=0.006)。
　　2.3 NKp44+NK細胞培養(yǎng)上清通過IL-22促進RA-FLS增殖
　　正常對照組與單用50μg/ml IL-22拮抗劑干預FLS增殖程度在24 h、48 h以及72 h后差異均無統(tǒng)計學意義(p=0.491，p=1.000，p=1.000)。
　　2.4 rhIL-22促R

15、A-FLS增殖呈現(xiàn)濃度依賴性
　　FLS增殖均呈濃度梯度變化趨勢，且差異具有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。
　　3.NKp44+NK細胞分泌IL-22促RA-FLS增殖信號通路機制
　　3.1 rhIL-22對RA-FLS STAT3-ERK1/2-P38總蛋白及磷酸化蛋白表達的影響
　　其他不同時間點各組p-STAT3蛋白相對表達量(p-STAT3/STAT3)均顯著升高，且差異具有統(tǒng)計學意義(p＜0.001)，

16、然而STAT3總蛋白以及內(nèi)參GAPDH蛋白的表達未見顯著差異(p＞0.05)。此外，ERK1/2和P38的總蛋白以及磷酸化蛋白表達亦均未見顯著表達差異(p＞0.05)。
　　3.2 AG490抑制rhIL-22活化RA-FLS細胞的STAT3信號通路
　　STAT3總蛋白以及內(nèi)參GAPDH蛋白的表達均未見顯著表達差異(p＞0.05)。
　　3.3 AG490抑制rhIL-22促進的RA-FLS增殖
　　單用100

17、μM AG490干預FLS培養(yǎng)24 h、48 h以及72 h后，體外FLS的增殖程度均顯著降低，不同時間點兩組間相比亦均具有統(tǒng)計學差異(p＜0.01)。
　　3.4 AG490抑制NKp44+NK細胞上清促進的RA-FLS增殖
　　單用100μM AG490干預FLS培養(yǎng)24 h、48 h以及72 h后，體外FLS的增殖程度均顯著降低，不同時間點兩組間相比亦均具有統(tǒng)計學差異(p＜0.01)。
　　結論：
　　1.