細胞周期末期促進復合物及其調節(jié)亞基Cdh1在缺血性腦損傷中的作用及機制.pdf

1、研究背景和目的:
　　 近年來，伴隨著臨床急救水平的進一步提高，很多心肺復蘇、心肌梗塞、窒息、休克等危重病人搶救成功率逐漸提高，而這些疾病所造成的全腦缺血損傷以及缺血再灌注后損傷已成為研究熱點。其中，腦缺血及再灌注后如何減少神經元死亡一直是臨床研究的難點。大量學者經過一系列腦缺血動物模型研究，分別從形態(tài)學、生化等多角度證實凋亡存在于腦缺血再灌注損傷中。因此，研究如何有效抑制凋亡是減輕腦缺血再灌注損傷的一個重要環(huán)節(jié)。
　　

2、 研究認為，Cdh1為細胞周期末期促進復合物(anaphase promoting complex，APC)的調節(jié)亞基之一，發(fā)現(xiàn)在增殖細胞中，其起到調控細胞周期的作用，是通過泛素化降解特定的底物蛋白來實現(xiàn)的。隨著最近一些年來的研究發(fā)現(xiàn)，Cdh1在成熟神經元中有大量表達，并且具有調節(jié)突觸傳遞、神經元存活以及神經元軸突生長等的作用。然而，目前尚不清楚關于APC-Cdh1在神經損傷等中樞神經系統(tǒng)其他方面的作用。Almeida等研究發(fā)現(xiàn)APC-

3、Cdh1具有抑制神經元凋亡的作用。推測APC-Cdh1的活性降低與Cyclin B的異常積聚可能是阿爾茨海默病及其他神經退行性疾病中神經元凋亡的機制之一。當前，在我國國內關于細胞周期末期促進復合物(anaphase promoting complex，APC)之調節(jié)亞基Cdh1在腦缺血再灌注損傷中的表達變化，以及對APC-Cdh1的表達進行干預在腦缺血再灌注損傷中的作用以及機制的研究還很少。
　　 本研究將首先通過建立大鼠全腦缺

4、血再灌注損傷模型，探討腦缺血再灌注損傷后APC-Cdh1的表達變化與神經元凋亡及神經功能改變的關系。然后通過下調APC-Cdh1活性，實現(xiàn)對腦缺血后神經元凋亡的影響，從在體實驗的角度探討APC-Cdh1在缺血性腦損傷中的作用及機制。繼而為選擇APC-Cdh1作為腦保護新策略提供實驗依據(jù)。
　　
　　 研究方法與結果1.大鼠全腦缺血再灌注損傷后神經元凋亡及認知功能的研究方法：取健康成年雄性SD大鼠80只，體重260～30

5、0g，隨機分成假手術組（SH組）、缺血再灌注組（IR組），每組各40只。根據(jù)再灌注的不同時間點分為1d、3d、7d三個亞組。假手術組只電凝椎動脈而不結扎兩側頸總動脈，缺血再灌注組采用改良4-VO法建立大鼠全腦缺血再灌注損傷模型，缺血時間為7min。根據(jù)分組于不同時間點取大鼠腦部制作冰凍切片，尼氏染色觀察海馬神經元的形態(tài)和海馬神經元的存活情況，TUNEL法檢測海馬CA1區(qū)凋亡細胞，分別計算神經元密度和凋亡指數(shù)。兩組大鼠建立模型后第七天后開

6、始，進行Morris水迷宮測試大鼠的學習記憶功能。
　　 結果：尼氏染色顯示，假手術組海馬神經元藍染，細胞排列整齊，海馬形態(tài)完整，CA1區(qū)神經細胞4～5層，排列整齊、細胞核大而圓，核仁清楚，亞甲胺藍染色顯示尼氏體豐富。缺血再灌注組第1d、3d、7d亞組海馬CA1區(qū)可見神經細胞脫失明顯，排列紊亂，胞體形狀不規(guī)則。尼氏體減少甚至消失、核變小、深染固縮。與假手術組比較，缺血再灌注組海馬CA1區(qū)神經元密度顯著下降（p<0.05）；TUN

7、EL法檢測顯示，假手術組海馬區(qū)偶見凋亡神經元。缺血再灌注組第1d、3d、7d亞組海馬CA1區(qū)神經元大量凋亡。與假手術組相比，缺血再灌注組第1，3，7天亞組凋亡指數(shù)明顯增加，差異有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。Morris水迷宮檢測：Morris水迷宮檢測發(fā)現(xiàn)，與假手術組相比，缺血再灌注組大鼠訓練階段第2—4天的尋臺時間明顯延長，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而第五天的記憶測試尋臺潛伏期也明顯長于假手術組，差異有顯著統(tǒng)計學意義（P＜

8、0.01）。
　　 2.大鼠全腦缺血再灌注損傷后APC-Cdh1的表達變化方法：健康雄性SD大鼠60只，體重260～300g，隨機分成假手術組（SH組）、模型組（IR組）。根據(jù)再灌注的不同時間點分為1d、3d、7d三個亞組。模型組采用改良4-VO法建立SD大鼠全腦缺血再灌注損傷模型，假手術組只電凝椎動脈而不結扎兩側頸總動脈，缺血時間為7min。根據(jù)分組在損傷后不同時間點，取大鼠腦部制作冰凍切片，免疫組化染色檢測Cdh1的表達部位

9、并且采用實時熒光定量PCR檢測大鼠海馬組織APC-Cdh1mRNA的表達以及采用Western Blot 檢測大鼠海馬組織APC-Cdh1蛋白的表達。
　　 結果：免疫組化檢測顯示APC-Cdh1在海馬區(qū)及皮層區(qū)中均有大量表達。熒光定量PCR顯示，對照組中，術后不同時點Cdh1mRNA表達比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0．05)；與對照組比較，模型組第1d 亞組Cdh1mRNA表達減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），第3d亞組

10、及第7d 亞組Cdh1mRNA表達升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；模型組中，與第1d亞組比較，第3d亞組Cdh1mRNA表達升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），與第3d亞組比較，第7d亞組Cdh1mRNA表達降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。Western Blot顯示，與對照組相比，缺血再灌注組術后第1d組 APC-Cdh1蛋白表達減少，術后第3d 顯著升高，術后7d又降低，差異有統(tǒng)計學意義（p<0.05）。

11、　　
　　 3.慢病毒介導的Cdh1-siRNA在大鼠腦缺血再灌注損傷后的表達及功能方法：150只雄性SD大鼠，體重260～300g，隨機分成生理鹽水組（A組，n=50）、空慢病毒組（B組，n=50）和重組慢病毒（C組，n=50），三組分別注射生理鹽水、空慢病毒和重組慢病毒。藥物注射3天后，各組大鼠均采用改良4-VO法建立SD大鼠全腦缺血模型，缺血時間為7min。建立模型七天后取大鼠腦部制作冰凍切片，以及取大鼠海馬組織，分別

12、用熒光定量PCR檢測海馬組織Cdh1mRNA表達和Western Blot檢測Cyclin B的變化。TUNEL法檢測海馬CA1區(qū)凋亡細胞，計算各組大鼠的凋亡指數(shù)。建立模型七天后，三組大鼠進行Morris水迷宮測試大鼠的學習記憶功能的變化。
　　 結果：熒光定量PCR顯示，與A組和B組比較，C組的Cdh1mRNA表達明降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。Western Blot顯示，與A組和B組比較，C組Cyclin B的表

13、達升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。TUNEL法檢測顯示：與A組和B組比較，C組凋亡指數(shù)顯著增加（P＜0.05）。Morris水迷宮檢測顯示，與A組和B組比較，C組大鼠學習階段即第一天至第四天大鼠尋臺時間明顯延長，而其記憶測試潛伏期也明顯長于A組或B組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　
　　 研究結論
　　 1.成功地構建了全腦缺血再灌注損傷模型。采用改良4-VO法建立SD大鼠全腦缺血再灌注損傷

14、模型后海馬神經元凋亡顯著增加，認知功能明顯下降。
　　 2.APC-Cdh1在大鼠正常腦組織以及全腦缺血再灌注損傷后有大量表達。而且，大鼠全腦缺血再灌注損傷后，在各不同的時點，大鼠腦組織中APC-Cdh1的表達明顯增高。推測APC-Cdh1可能與中樞神經系統(tǒng)的損傷有著密切的關系，參與全腦缺血再灌注損傷的病理生理過程。
　　 3.大鼠海馬組織注射慢病毒介導的Cdh1RNA干擾后，下調了Cdh1的表達，大鼠全腦缺血再灌注

15、損傷后大鼠海馬組織Cyclin B的表達明顯增高。APC-Cdh1可能是通過Cyclin B堆積介導缺血性神經元凋亡的。
　　
　　 研究總結
　　
　　 本課題首先通過建立改良4-VO全腦缺血再灌注損傷模型，揭示了全腦缺血再灌注后對大鼠海馬神經元造成損傷，海馬神經元出現(xiàn)遲發(fā)性死亡，大鼠的學習記憶能力下降，認知功能明顯降低。然后在建立大鼠全腦缺血再灌注后，發(fā)現(xiàn)的大鼠海馬區(qū)APC-Cdh1的表達升高。提

16、示APC-Cdh1可能參與全腦缺血再灌注損傷等病理生理過程。然后通過腦立體定向注射Cdh1RNA干擾慢病毒載體至大鼠的海馬后，在相應的時間點建立改良4-VO全腦缺血再灌注損傷模型。觀察慢病毒介導的Cdh1RNA干擾對全腦缺血再灌注損傷的影響，發(fā)現(xiàn)Cdh1的表達下調，Cyclin B表達升高，大鼠的學習記憶能力下降，認知功能明顯降低。本實驗初步研究了APC-Cdh1在全腦缺血再灌注后在腦組織中的表達特點，以及全腦缺血再灌注后的作用。進一步