人汗腺細胞體外培養(yǎng)條件的關鍵因素及作用機制.pdf

1、我國每年有上千萬燒傷病人，其中輕度燒傷的患者尚可通過其深層未受創(chuàng)部分為模板進行皮膚修復，但深度燒傷的病人，汗腺不能通過皮下剩余正常的組織向上進行后期修復，嚴重影響了燒傷患者的生活質量。因此汗腺細胞應用于組織工程皮膚構建和皮膚損傷修復的研究已成為熱點。汗腺細胞生物學特征和汗腺再生研究啟步較晚,近年來針對如何有效促進汗腺細胞體外增殖，維持汗腺細胞生物學特征和功能的研究還在探索中。目前國際上用于培養(yǎng)汗腺細胞的培養(yǎng)基分為有血清和無血清兩類培養(yǎng)基

2、，但其擴增和傳代及培養(yǎng)體系尚不完善。本文旨在比較不同培養(yǎng)基對于維持汗腺細胞生物學特征和增殖能力的基礎上，進一步探索血清和音猬基因（Sonic Hedgehog）在汗腺體外培養(yǎng)條件中的作用和機制，進而優(yōu)化人汗腺細胞體外培養(yǎng)的條件。
　　第一部分血清在人汗腺細胞體外培養(yǎng)條件中的作用和機制
　　目的:比較含血清和無血清培養(yǎng)基對汗腺細胞生物學特征和功能的影響，并探討血清在汗腺細胞培養(yǎng)基中的作用和機制。
　　方法:利用手術廢棄的

3、六指全層皮膚，去除表皮后，在倒置顯微鏡下分離出汗腺組織，并將其培養(yǎng)在含血清的 SG培養(yǎng)基中（DMEM/F12+10％FBS，hEGF，Hydrocortison，Triiodothyronine，Insulin-Transferrin-selenium)。約一周后，待汗腺細胞向外增殖，將增殖的汗腺細胞分別培養(yǎng)在 SG培養(yǎng)基，KGM-2培養(yǎng)基(KBM-2，BPE，insulin，hydrocortisone，transferrin，epi

4、nephrine，GA-100)和SG:KGM-2為1：1的混合培養(yǎng)基中。通過細胞形態(tài)、細胞增殖，Real-time PCR、體外三維培養(yǎng)等檢測方法對三種培養(yǎng)基培養(yǎng)的汗腺細胞的生物學特征和功能進行鑒定。
　　結果:（1）汗腺細胞在三種不同培養(yǎng)基中比較性地培養(yǎng)一周后，混合培養(yǎng)基中培養(yǎng)的汗腺細胞呈更高的增殖率及更穩(wěn)定的細胞形態(tài)；（2）Real-time PCR結果顯示，混合培養(yǎng)基中培養(yǎng)的汗腺細胞所表達的標志基因（SMA，K77，CEA

5、，K8，K18，EDAR，C-MYC，Klf-4，OCT-4）都高于SG培養(yǎng)基和KGM-2培養(yǎng)基中所培養(yǎng)的汗腺細胞，并經(jīng)三維培養(yǎng)，能形成類似汗腺腺體的結構；（3）KGM-2培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞高表達K5,K14等角質化細胞標志基因，并能形成成熟的上皮組織。上述研究表明，含血清的培養(yǎng)基有利于汗腺細胞體外增殖和生物學特征的維持，而無血清的KGM-2培養(yǎng)基使汗腺細胞失去其生物學特征和功能的原因是，無血清培養(yǎng)體系中汗腺細胞會快速分化為角質化細胞。<

6、br>　　結論：本研究建立的混合培養(yǎng)基，不僅能有效提高汗腺細胞體外增殖能力，還能更好地維持汗腺細胞的生物學特征和功能。
　　第二部分 Sonic Hedgehog對體外培養(yǎng)汗腺細胞生物學特征和功能的作用
　　目的:探討音猬基因（Sonic Hedgehog）即Shh在汗腺細胞體外培養(yǎng)中的作用，進一步優(yōu)化目前的汗腺細胞體外培養(yǎng)體系。
　　方法:利用手術廢棄的六指全層皮膚，去除表皮后，在倒置顯微鏡下分離出汗腺組織，并將其培

7、養(yǎng)在含血清的 SG培養(yǎng)基中（DMEM/F12+10%FBS，hEGF，Hydrocortison，Triiodothyronine，Insulin-Transferrin-selenium)。約一周后，待汗腺細胞向外增殖，將增殖的汗腺細胞分別培養(yǎng)在第一部分中的混合培養(yǎng)基和添加 Shh因子的混合培養(yǎng)基中。通過細胞形態(tài)、細胞增殖、Real-time PCR、體外三維培養(yǎng)等檢測方法對兩種培養(yǎng)基培養(yǎng)的汗腺細胞的生物學特征和功能進行鑒定。

8、　　結果:（1）汗腺細胞在兩種不同培養(yǎng)基中培養(yǎng)一周后，添加有Shh混合培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細胞同樣呈汗腺細胞樣形態(tài)，且其生長速率與未添加 Shh的混合培養(yǎng)基相近；（2）Real-time PCR結果顯示，添加有Shh混合培養(yǎng)基中培養(yǎng)的汗腺細胞所表達的標志基因（SMA，K77，CEA，K8，K18，EDAR，C-MYC，KLF-4，OCT-4）相比混合培養(yǎng)基所培養(yǎng)的汗腺細胞有顯著提高，并與原代汗腺細胞接近；（3）經(jīng)三維培養(yǎng)，添加有Shh混合培養(yǎng)

9、基中的汗腺細胞形成汗腺樣腺體的結構的數(shù)量明顯多于未添加Shh的混合培養(yǎng)基。
　　結論：在混合培養(yǎng)基中添加Shh可以更有效地維持汗腺細胞的生物學特征和功能，在體外三維組織培養(yǎng)中形成更多的汗腺樣結構。
　　總結
　　本研究通過對人汗腺細胞培養(yǎng)基的比較，證明了混合培養(yǎng)基更適用于培養(yǎng)汗腺細胞，其中血清是維持汗腺細胞生物學特征的關鍵因素。在此基礎上，我們在混合培養(yǎng)基中添加了Shh因子，證明了添加Shh因子可以提高汗腺細胞在體外三