血管抑素滴眼劑制備及其藥代動力學的相關研究.pdf

1、目的：
　　 眼部新生血管性疾病是多種致病因素所致的眼部并發(fā)癥，是損害視力的主要因素之一，包括由于燒傷或移植而引起的角膜血管新生、各種原因引起的脈絡膜血管新生及糖尿病引起的視網(wǎng)膜病變。作為一種血漿纖溶酶原的降解片段，血管抑素(angiostantin，As)以其強大的抗血管生成作用受到了人們的極大關注，自1994年O'Reilly等在荷蘭小鼠血清及尿中發(fā)現(xiàn)至今的近20年中，國內(nèi)外的研究者對其分子結構、抗血管生成的分子機制及提取方

2、法進行了深入而廣泛的探討，并取得了可喜的成果。多年來，伴隨著血管抑素的制備方法日臻完善，國內(nèi)外許多學者已應用血管抑素對角膜、脈絡膜、視網(wǎng)膜等眼部新生血管性疾病的防治工作做了大量的基礎和臨床研究，取得了顯著的效果。而目前國內(nèi)外血管抑素的相關研究仍停留在動物實驗階段，為了推動血管抑素更早更快的進入臨床應用，如能對血管抑素滴眼液的制備方法加以優(yōu)化，明確其處方，勢必將極大推動血管抑素在臨床的運用。因此，以《中國藥典》2010年最新版相關內(nèi)容為依

3、據(jù)，在借鑒前人相關成功經(jīng)驗的基礎上，本研究擬對血管抑素滴眼液的制備工藝進行完善，選擇合適的處方制備重組人Kringle1-3血管抑素滴眼劑，對血管抑素滴眼液的外觀、理化性質進行考察，運用紫外光譜法與Draize法分別對重組人Kringle1-3血管抑素滴眼劑的穩(wěn)定性與刺激性進行研究。高效液相色譜法(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)測定血管抑素滴眼液在玻璃體中的濃度及分布，擬闡明血管

4、抑素滴眼液的藥代動力學。通過其在眼內(nèi)藥代動力學指標的檢測，確定血管抑素的處方，旨在探索一種可用于臨床治療新生血管性疾病的血管抑素滴眼劑，以期規(guī)模化生產(chǎn)，使其適用于臨床工作的需要，造福人類。
　　 方法與過程：
　　 1、血管抑素滴眼劑的制備:配制含0.1％制備量的玻璃酸鈉（滴眼液級）的磷酸鹽緩沖溶液適量，稱取0.01％制備量的苯扎氯銨，溶解于適當體積的磷酸鹽緩沖液中，加入玻璃酸鈉溶液，后向其中加入質量分數(shù)為0.1％的ED

5、TA-Na2(乙二胺四乙酸二鈉鹽)，充分混勻，補加注射用水至制備量，即得血管抑素滴眼劑賦形劑溶液。將血管抑素滴眼劑賦形劑溶液于超凈工作臺中用0.22μm微孔濾膜除菌過濾得無菌血管抑素滴眼劑賦形劑溶液，量取適當體積無菌賦形劑溶液溶解適量重組人Kringle1-3血管抑素原料藥，渦旋震蕩至澄清透明，配制質量分數(shù)為0.01％（即質量濃度為100μg/ml）血管抑素滴眼劑若干，封裝，即得重組人Kringle1-3血管抑素滴眼劑。
　　

6、2、血管抑素滴眼液質量控制:1）性狀:采用留樣觀察法，觀察血管抑素滴眼液的顏色、澄明度，鑒定是否存在異物。（按照《中國藥典》2010版附錄Ⅸ關于澄明度及可見異物的檢查法進行測定）;2）血管抑素滴眼液pH的檢測:使其pH符合《中國藥典》2010年版有關滴眼液的規(guī)定。3）血管抑素滴眼液含量的測定:紫外吸收光譜法測定血管抑素滴眼液中血管抑素的含量;4）血管抑素滴眼液的刺激性檢驗:采用新西蘭大白兔作為實驗模型，運用Draize試驗進行評價;5）

7、血管抑素滴眼液的穩(wěn)定性檢驗:因為常溫下血管抑素理化性質不穩(wěn)定，所以將血管抑素滴眼劑樣品分別置于4℃±1℃及-20℃±2℃條件下保存，觀察樣品放置1月、3月及5月的外觀、澄明度及可見異物（沉淀），分別測定放置1、3、5月時樣品于280nm處的吸光度值，計算各時間點吸光度均值，評估重組人Kringle1-3血管抑素滴眼劑樣品第1、3、5月相對于0個月的主藥含量下降值，考察滴眼劑的穩(wěn)定性。
　　 3、血管抑素滴眼液在兔眼內(nèi)組織的分布:

8、健康、無眼疾新西蘭大白兔10只，隨機分成5組，每組2只4眼，血管抑素滴眼液滴眼給藥后選取0.5、1、2、5、8h5個取材點，各取材點取2只新西蘭大白兔共4眼角膜、房水及玻璃體組織，高效液相色譜法測定給藥0.5、1、2、5、8h后血管抑素滴眼液在角膜、房水及玻璃體中的濃度計分布（重復此實驗巾的HPLC實驗2次），繪制標準曲線并考察精密度及回收率。
　　 4、血管抑素滴眼液眼內(nèi)藥代動力學的檢測:將兔眼角膜、房水及玻璃體組織中的藥物濃

9、度經(jīng)實用藥物動力學程序(3p97)進行擬合，擬合出符合藥動學房室模型，并計算相關藥動學參數(shù)。
　　 結果：
　　 1、性狀測定結果:本實驗制備的血管抑素滴眼液為無色澄清透明液體，按照《中國藥典》2010版附錄Ⅸ關于澄明度及可見異物的檢查法進行測定，經(jīng)檢查血管抑素滴眼劑符合此標準。血管抑素滴眼液pH值為7.35，符合人眼對滴眼劑酸堿度的要求，經(jīng)用數(shù)字貝克曼溫度計測定重組人Kringle1-3血管抑素滴眼劑滲透壓，結果顯示其

10、與淚液等滲。本制備工藝中0.1％玻璃酸鈉的加入使重組人Kringle1-3血管抑素滴眼劑的黏度維持在合適水平(4.0-5.0 cPa·s)，延長了滴眼劑眼內(nèi)滯留時間，促進了滴眼劑在眼內(nèi)的分布。
　　 2、穩(wěn)定性結果:(1)本實驗制得的重組人Kringle1-3血管抑素滴眼劑不同溫度條件下存放5個月時，其外觀及澄明度不發(fā)生變化，無沉淀產(chǎn)生，理化性質穩(wěn)定。(2)在含量考察方面，與0月（對照）吸光度相比，重組人Kringle1-3血管

11、抑素滴眼劑4℃條件下保存5月的吸光度值與0月（對照）相比降低明顯，具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05，表2），而-20℃條件下的各時間點吸光度則無顯著性差異(P＞0.05)（表2）;-20℃條件下各時間點吸光度均高于4℃條件下對應時間點的吸光度，且-20℃條件下1月、3月、5月含量降低值均低于4℃條件下對應時間點的含量降低值，表明重組人Kringle1-3血管抑素滴眼劑在低溫條件下保存穩(wěn)定性較好，且-20℃低溫條件下保存其穩(wěn)定性明顯優(yōu)于4℃條

12、件。
　　 3、刺激性結果:在藥物安全性評價中，Draize試驗是評價眼刺激性的主要方法，結果發(fā)現(xiàn)血管抑素滴眼劑給藥組與賦形劑組各時間點的Draize評分均＜3分，表明血管抑素滴眼劑對兔眼幾無刺激性。各組在給藥期間兔眼主要表現(xiàn)與給藥前基本相同，即結膜輕度充血，偶有少量分泌物等。
　　 4、HPLC條件測定:原藥通過與輔料溶劑色譜圖對照發(fā)現(xiàn):3.3min與3.6min左右均有峰出，而原藥在5.625min左右有另一峰出現(xiàn)，

13、而溶劑色譜圖在對應的時間點未有峰出現(xiàn)，說明血管抑素原藥的出峰時間大致為5.6min左右。
　　 5、空白玻璃體HPLC圖譜:保留時間為5.844min的時間點有峰出現(xiàn)，對比100上g/ml的血管抑素原藥的色譜圖中血管抑素于5.6min左右出峰，相同的5-20％乙腈(含0.1％TFA)-95-80％水(含0.1％TFA)-35min梯度洗脫條件及相同的210nm檢測波長下，在近似相等的保留時間點均有峰出，證明眼空白玻璃體組織中有內(nèi)

14、源性的血管抑素存在。
　　 6、給藥后各時間點玻璃體HPLC圖譜測定:通過收集滴眼給藥后0.5h、1.0h、2.0h、5.0h及8.0h的玻璃體樣品進行HPLC發(fā)現(xiàn):各時間點血管抑素原藥的出峰峰高及峰面積均高于空白玻璃體樣品，給藥0.5h后血管抑素出峰峰高及峰面積分別增加21.76％與20.15％，到給藥1h血管抑素出峰峰高及峰面積增加比例最多，分別達到153.59％與511.15％，以后各點原藥出峰的峰高及峰面積增加值逐漸減小

15、，到8.0h時間點降為46.97％與208.48％。
　　 結論
　　 1、制備重組人Kringle1-3血管抑素滴眼劑性狀:本實驗制備的血管抑素滴眼液為無色澄清透明液體，經(jīng)澄明度及可見異物的檢查方法檢測后符合《中國藥典》2010版附錄Ⅸ的對其的要求，血管抑素滴眼液pH值為7.35，符合人眼對滴眼劑酸堿度的要求，且其與淚液等滲，本制備工藝中0.1％玻璃酸鈉的加入使重組人Kringle1-3血管抑素滴眼劑的黏度維持在合適水

16、平（4.0-5.0 cPa·s），延長了滴眼劑眼內(nèi)滯留時間，促進了滴眼劑在眼內(nèi)的分布?？芍緦嶒炛苽涞难芤炙胤稀吨袊幍洹?010對滴眼劑的要求。
　　 2、重組人Kringle1-3血管抑素滴眼劑的穩(wěn)定性考察中，通過在制各處方中加入0.1％的EDTA-Na2做為螯合穩(wěn)定劑，血管抑素滴眼劑在-20℃條件下保存5月的吸光度值與0月對照組相比降低不多，含量下降值僅為（13.31±3.93）％，較有效地克服了血管抑素做為糖蛋白本身

17、穩(wěn)定性低的缺點，提高了制劑的穩(wěn)定性。
　　 3、重組人Kringle1-3血管抑素滴眼劑的刺激性考察中，各組在給藥期間兔眼主要表現(xiàn)與給藥前基本相同，即結膜輕度充血，偶有少量分泌物等，給藥后各時間點的情況根據(jù)Draize評分分值均小于3分，與賦形劑及生理鹽水組分值差別不大，表明本制備方法所得血管抑素滴眼劑對兔眼無刺激性。
　　 4、血管抑素(angiostatin，AS)屬血漿纖溶酶原的內(nèi)部片段，已經(jīng)證實的血管抑素有Kri

18、ngle1-3、Kringle4、Kringle1-4、Kringle1-4.5與Kringle5等5種。本實驗通過改變流動相配比、洗脫條件及檢測波長等方法，摸索出在210nm，5-20％乙腈，95-80％水，35min梯度洗脫條件下可較好地分離重組人Kringle1-3血管抑素，得到較好的峰形，在此條件下重組人Kringle1-3血管抑素的出峰時間約為5.6min左右。取空白玻璃體樣品按摸索出的條件進行HPLC發(fā)現(xiàn):在近似相等的保留時

19、間有峰出，且峰形單一，表明在眼部組織中有內(nèi)源性的Kringle1-3血管抑素存在。
　　 5、藥物滴眼后，在不同時間點取材進行HPLC，實驗證實各時間點的血管抑素原藥峰高及峰面積均高于空白玻璃體組織，且原藥在滴眼1h后在玻璃體的分布值達到最大，此后隨著時間的推移Kringle1-3血管抑素在眼內(nèi)的分布開始逐漸降低，到8h時降低幅度最大，峰高僅比空白組織增加46.97％，峰面積增加208.48％。說明滴入眼內(nèi)的血管抑素在眼部1.0