AMH對豬卵泡膜細(xì)胞類固醇激素合成酶的影響極其機制研究.pdf

1、抗繆勒氏管激素（anti-müllerian hormone，AMH）是轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor，TGF-β）超家族成員之一，由生長卵泡中的顆粒細(xì)胞分泌，能夠抑制原始卵泡的募集和降低生長卵泡對促卵泡素的敏感性，但其作用機制尚不清楚。豬是醫(yī)學(xué)試驗上理想的動物模型，為了深入探討AMH在對豬卵泡膜細(xì)胞在類固醇合成上的作用，開展了如下實驗：
　　試驗一：AMH在豬上的表達(dá)模式
　　本試驗主

2、要采用RT-qPCR技術(shù)，分析了AMH及AMHR在豬不同組織器官上以及在不同卵泡直徑上的表達(dá)規(guī)律；利用ELISA技術(shù)，分析了在不同直徑卵泡液中AMH的表達(dá)規(guī)律。試驗結(jié)果表明：AMH及AMHR2在豬睪丸和卵巢中高表達(dá)，而在其它組織中不表達(dá)或表達(dá)量極低。顆粒細(xì)胞中AMH mRNA水平和卵泡中蛋白水平均呈現(xiàn)隨著卵泡直徑的增大，AMH的表達(dá)量逐漸降低；在大卵泡（＞5mm）顆粒細(xì)胞中，AMHR2表達(dá)量最高（P<0.05），而小卵泡及中卵泡（直徑1

3、-5mm）的顆粒細(xì)胞中AMHR2的表達(dá)量最低，且無明顯差異（P＞0.05）。這說明，AMH及AMHR2的表達(dá)量與卵泡的生長發(fā)育階段有關(guān)。
　　試驗二：豬卵巢卵泡膜細(xì)胞的分離純化和培養(yǎng)
　　采用三種方法進(jìn)行了豬卵泡膜細(xì)胞的優(yōu)化，方法A：注射針頭刮去顆粒細(xì)胞層，方法B：手術(shù)剪碎膜細(xì)胞層。A和B法均用IV型膠原酶消化后percoll密度梯度離心獲取44％和35%中間層為膜細(xì)胞，C法直接將膜細(xì)胞層用IV型膠原酶消化后采用兩次perc

4、oll梯度離心獲取卵泡膜細(xì)胞。利用波形蛋白、角蛋白、因子Ⅷ三種蛋白的抗體進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光染色鑒定和流式細(xì)胞術(shù)鑒定細(xì)胞純度。結(jié)果表明：方法A獲得的膜細(xì)胞存活率及純度均顯著高于方法B和C（92.00% vs.80.33%,85.00%；95.77%vs.87.87%,90.87%）（P<0.05）；方法B獲得的細(xì)胞數(shù)顯著高于方法A和C（1.06×107 vs.0.74×107,0.86×107）（P<0.05），但耗時顯著低于方法A和C（2

5、36.67min vs.260.00min，268.33min）（P<0.05）。結(jié)論：方法A可獲得較高膜細(xì)胞純度和細(xì)胞活力，本實驗為進(jìn)一步研究膜細(xì)胞的功能提供了基礎(chǔ)。
　　試驗三：AMH對卵泡膜細(xì)胞上類固醇激素合成酶的影響及機制研究
　　FSH和AMH單獨或是共同添加于卵泡膜細(xì)胞中48 h后，通過Real-time qPCR發(fā)現(xiàn)：在豬卵泡膜細(xì)胞中，F(xiàn)SH和AMH無論是單獨作用還是聯(lián)合作用，對LHCGR、STAR、CYP11

6、A1、CYP17A1以及3β-HSD的表達(dá)均無顯著影響（P＞0.05），但FSH或AMH單獨作用能夠顯著提高STAR mRNA的表達(dá)（P＜0.05），F(xiàn)SH和AMH共同作用對STAR mRNA的表達(dá)水平無顯著影響（P＞0.05）。這表明，F(xiàn)SH和AMH在促進(jìn)類固醇合成起始過程中可能存在協(xié)同作用。
　　LH和AMH單獨或共同添加于卵泡膜細(xì)胞中48 h后，通過Real-time qPCR發(fā)現(xiàn)：在豬卵泡膜細(xì)胞中，LH單獨作用能夠誘導(dǎo)LH

7、CGR、CYP11A1、CYP17A1以及3β-HSD mRNA表達(dá)水平上調(diào)（P＜0.05）；AMH單獨作用對LHCGR、STAR、CYP11A1、CYP17A1以及3β-HSD mRNA表達(dá)水平無顯著影響（P＞0.05）；LH和AMH聯(lián)合作用時，LHCGR、CYP17A1、3β-HSD mRNA表達(dá)水平與對照組及AMH單獨作用組均無顯著差異（P＞0.05），但顯著低于LH單獨作用組的水平（P＜0.05），而對STAR、CYP11A1

8、mRNA表達(dá)水平無顯著影響（P＞0.05）。Forskolin和AMH單獨或共同添加于卵泡膜細(xì)胞中48h后，通過Real-time qPCR發(fā)現(xiàn)，在豬卵泡膜細(xì)胞中，F(xiàn)orskolin能夠顯著上調(diào)LHCGR、CYP11A1、CYP17A1以及3β-HSD mRNA的水平（P＜0.05）；Forskolin和AMH共同作用也可上調(diào)LHCGR、CYP11A1、CYP17A1以及3β-HSD mRNA表達(dá)水平，且與Forskolin單獨作用無顯

9、著差異。這表明，在豬卵泡膜細(xì)胞上，AMH并不是以cAMP作為通路調(diào)控的。
　　通過普通PCR發(fā)現(xiàn)，豬卵泡膜細(xì)胞上存在AMHR2。在AMHR2被siRNA干擾的膜細(xì)胞中添加LH和AMH，通過Real-time qPCR發(fā)現(xiàn)：LH能夠上調(diào)LHCGR、CYP11A1、CYP17A1以及3β-HSD mRNA水平（P＜0.05）；但AMH對LHCGR、STAR、CYP11A1、CYP17A1以及3β-HSD mRNA水平無顯著影響（P＞0

10、.05）；LH和AMH共同作用時，LHCGR、CYP11A1和CYP17A1 mRNA表達(dá)水平均與對照組無顯著差異（P＞0.05），而3β-HSD mNRA表達(dá)水平顯著上調(diào)（P＜0.05）。這表明，AMH在卵泡膜細(xì)胞上是通過3β-HSD進(jìn)而調(diào)控LH誘導(dǎo)的類固醇合成。
　　綜上所述，本研究表明，AMH在豬上的表達(dá)模式與其它物種的相似，AMH及AMHR2的表達(dá)量與卵泡的生長發(fā)育階段有關(guān)。首次發(fā)現(xiàn)，豬的卵泡膜細(xì)胞上表達(dá)AMHR2，并且A