慢性心衰大鼠心肌細胞鈣調控異常及藥物干預的研究.pdf

1、第一部分慢性心力衰竭與心肌細胞異常的鈣循環(huán)
　　 目的：心肌細胞肌漿網的鈣循環(huán)異常是心力衰竭發(fā)病的主要原因之一，但其確切機理和相關分子機制還不甚清楚，本實驗以大鼠慢性心衰模型作為研究對象，在細胞和亞細胞水平對心肌細胞胞漿內鈣瞬變、肌漿網內鈣容量以及鈣調控相關蛋白表達的變化進行了研究，從而更深入地了解心衰的分子機制。
　　 方法：
　　 （1）實驗分組：28只雄性SD大鼠隨機分為兩組，假手術組（n=10）和心衰組（

2、n=18）；（2）慢性心衰模型的建立：心衰組大鼠行冠狀動脈左前降支永久性結扎，假手術組大鼠除未結扎冠脈外，其余手術步驟均同心衰組。4周后分別觀察各組動物存活率和心功能各項指標；（3）心肌細胞L-型鈣電流、胞漿內鈣瞬變和肌漿網內鈣容量的測定：采用常規(guī)酶解法分離心室肌細胞，Fluo-3/AM 負載心肌細胞，運用全細胞膜片鉗-激光掃描共聚焦顯微鏡聯機技術同步記錄各組大鼠心肌細胞L-型鈣電流和胞漿內鈣瞬變（即鈣誘導鈣瞬變）；利用咖啡因誘導鈣瞬變

3、的方法，間接記錄肌漿網內鈣容量（即咖啡因誘導鈣瞬變）的變化；同時利用Fluo-5N/AM 負載心肌細胞，直接記錄肌漿網內鈣容量的變化；（4）鈣調控蛋白Mrna 轉錄量的檢測：提取各組大鼠心肌組織總RNA，采用Real-time quantitative RT-PCR 方法檢測鈣調控蛋白Mrna的轉錄量；（5）鈣調控蛋白表達的測定：將各組大鼠左室心肌組織的膜蛋白提取后，采用Western-blot 法測定鈣調控蛋白的表達水平，并進行蛋白表

4、達半定量分析；（6）
　　 統(tǒng)計學分析：利用SPSS11.5 統(tǒng)計軟件進行數據處理，所有數據以均數±標準差（X±SD）表示，兩組間均數的比較采用t 檢驗, 率的比較采用Fisher’s Exact 檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結論：慢性心衰大鼠心肌細胞內鈣循環(huán)異常主要是由與鈣釋放和鈣回攝相關的鈣調控蛋白表達的異常所引起。具體如下：
　　 （1）慢性心衰大鼠心肌細胞L-型鈣通道（DHPR）表達下調

5、，造成鈣誘導鈣釋放（CICR）過程出現異常，最終導致心肌興奮-收縮耦聯（ECC）障礙，心肌收縮力下降。
　　 （2）慢性心衰大鼠心肌細胞內FKBP12.6表達下調，使其對RyR2的穩(wěn)定作用減弱，導致RyR2在心肌細胞舒張期泄漏過多的Ca2+，使肌漿網內鈣容量降低，從而引起ECC 過程中所需要的鈣釋放量減少，最終導致心肌收縮力降低。
　　 （3）慢性心衰大鼠心肌細胞內鈣泵（SERCA2a）表達下調，致ECC 結束后鈣回攝功

6、能障礙，導致肌漿網內鈣容量減少，最終造成心肌收縮力下降。
　　 第二部分氧化苦參堿對慢性心衰大鼠心肌保護作用機制的研究
　　 目的：氧化苦參堿（Oxymatrine, OMT）是從豆科槐屬植物苦豆子提取的氧化生物堿，屬于四環(huán)的喹嗪啶類，具有抗炎、抗過敏、保肝、抗病毒及抗寄生蟲等多方面藥理作用，是臨床上常用的治療肝炎的藥物。本實驗以慢性心衰大鼠作為模型，在先前研究的基礎上探討氧化苦參堿對心肌細胞內鈣離子，鈣通道及鈣調節(jié)相關

7、蛋白的影響，以期獲得其心臟保護作用的機制，并為此藥在臨床上的開發(fā)及應用提供基礎理論支持。
　　 方法：
　　 （1）實驗分組：60只雄性SD大鼠隨機分為五組，假手術組（n=12）、心衰組（n=12）、低劑量OMT 干預組（n=12）（25mg/kg, qd）、中劑量OMT 干預組（n=12）（50mg/kg, qd）和高劑量OMT 干預組（n=12）（100mg/kg, qd）；（2）心衰模型的建立：心衰組和藥物干預組大

8、鼠行冠狀動脈左前降支永久性結扎，假手術組大鼠除未結扎冠脈外，其余手術步驟均同心衰組。4周后分別檢測各組動物存活率和心功能各項指標；（3）心肌細胞L-型鈣電流、胞漿內鈣瞬變和肌漿網內鈣容量的測定：采用常規(guī)酶解法分離心室肌細胞，Fluo-3/AM 負載心肌細胞，運用全細胞膜片鉗-激光掃描共聚焦顯微鏡聯機技術同步記錄各組大鼠心肌細胞L-型鈣電流和胞漿內鈣瞬變；利用咖啡因誘導鈣瞬變的方法，間接記錄肌漿網內鈣容量；（4）透射電子顯微鏡形態(tài)學觀察：

9、各組大鼠心室肌組織被切成1mm3的小塊后，經固定、脫水、包埋、修塊、切片、染色等處理后于電鏡下觀察并拍照；（5）鈣調控蛋白Mrna 轉錄量的檢測：提取各組大鼠心肌組織總RNA，采用Real-time quantitative RT-PCR 方法檢測鈣調控蛋白Mrna的轉錄量；（6）鈣調控蛋白表達的測定：將各組大鼠左室心肌組織的膜蛋白提取后，采用Western-blot 法測定鈣調控蛋白的表達水平，并進行蛋白表達半定量分析；（7）統(tǒng)計學分

10、析：采用SPSS11.5 統(tǒng)計軟件進行數據處理，所有數據以均數±標準差（X±SD）表示，各組間均數的比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間兩兩比較時用LSD 法。P<0.05 認為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結論：氧化苦參堿（OMT）對慢性心衰大鼠的心肌細胞具有保護作用，而這種保護作用表現在大鼠心功能的改善。具體如下：
　　 （1）在氧化苦參堿（OMT）的干預下，慢性心衰大鼠心肌細胞L-型鈣通道（DHPR）表達上調，促