中國(guó)部分地區(qū)產(chǎn)NDM耐藥菌的流行及耐藥特性研究.pdf

1、產(chǎn)新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶（NDM）耐藥菌自2010年被傳染病領(lǐng)域國(guó)際頂級(jí)雜志《柳葉刀》報(bào)道以來(lái)，以驚人的傳播速度和超強(qiáng)的耐藥性引起人們的廣泛關(guān)注。目前，在全球范圍內(nèi)已有超過(guò)20個(gè)國(guó)家出現(xiàn)產(chǎn)NDM耐藥菌病例，除南美洲西部、非洲中部個(gè)別國(guó)家未報(bào)道外，其他國(guó)家和地區(qū)均有報(bào)道。攜帶blaNDM基因耐藥菌對(duì)包括碳青霉烯類的常用抗菌藥物均耐藥，尚缺乏明確的治療方案。研究發(fā)現(xiàn)，NDM-1有NDM-2到NDM-16共15個(gè)突變體，多由不動(dòng)桿菌屬細(xì)菌、大

2、腸埃希氏菌和肺炎克雷伯氏菌攜帶。越來(lái)越多的數(shù)據(jù)表明產(chǎn)NDM耐藥菌已在全球范圍流行并引發(fā)多種類型感染，是威脅人類健康的主要公共衛(wèi)生問(wèn)題之一。因此，有效控制和治療產(chǎn)NDM耐藥菌感染具有重要現(xiàn)實(shí)意義。
　　細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)是防控產(chǎn)NDM耐藥菌的重要組成部分，及時(shí)準(zhǔn)確了解產(chǎn)NDM耐藥菌的流行現(xiàn)狀和特點(diǎn)，是預(yù)防和控制產(chǎn)NDM耐藥菌感染的關(guān)鍵所在。既往研究發(fā)現(xiàn)，我國(guó)主要以攜帶blaNDM-1基因的不動(dòng)桿菌為主，而關(guān)于其他NDM型別和其他菌屬在我國(guó)

3、的流行特點(diǎn)，研究報(bào)道甚少。為更全面了解產(chǎn)NDM耐藥菌在我國(guó)的流行現(xiàn)狀、流行規(guī)律及傳播機(jī)制，本課題對(duì)2010年至2015年期間來(lái)自全國(guó)11個(gè)省市、25家醫(yī)院的1559株非重復(fù)碳青霉烯類耐藥菌（含醫(yī)院污水來(lái)源156株）進(jìn)行分析檢測(cè)，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）法篩查blaNDM基因，運(yùn)用流行病學(xué)及統(tǒng)計(jì)分析方法對(duì)不同來(lái)源、不同菌屬、不同型別產(chǎn)NDM耐藥菌引起感染性疾病的三間分布進(jìn)行分析；利用基于全基因組平均核苷酸一致性（ANI）分析法及16s

4、RNA序列分析對(duì)產(chǎn)NDM耐藥菌進(jìn)行菌種鑒定，利用核心基因組多位點(diǎn)序列分型（cgMLST）方法，對(duì)不同菌屬產(chǎn)NDM耐藥菌進(jìn)行聚類分型；VITEK2全自動(dòng)微生物藥敏分析儀對(duì)攜帶blaNDM基因菌株進(jìn)行耐藥性分析；同時(shí)，利用Southern blot雜交法、濾膜接合法和細(xì)菌全基因組測(cè)序分別對(duì)其進(jìn)行blaNDM基因定位及轉(zhuǎn)移特性、blaNDM基因周邊結(jié)構(gòu)分析，以期明確中國(guó)部分地區(qū)產(chǎn)NDM耐藥菌的分子特征，從分子水平解釋產(chǎn)NDM耐藥菌blaNDM

5、基因可能的傳播和流行規(guī)律。
　　本研究的主要結(jié)果和結(jié)論如下：
　　1.不同型別、不同菌屬產(chǎn)NDM耐藥菌已在中國(guó)部分地區(qū)流行播散。
　　1559株實(shí)驗(yàn)菌中篩查出77株攜帶blaNDM基因菌株，陽(yáng)性率為4.9％。
　　1）時(shí)間分布特點(diǎn)：患者來(lái)源耐藥菌的blaNDM基因陽(yáng)性率逐年升高。
　　2）空間分布特點(diǎn)：我國(guó)東北、華北、華東、中南四大地區(qū)，11個(gè)城市均有
　　產(chǎn)NDM耐藥菌，其中北京、上海、?？?、廈門等

6、一線和沿海城市陽(yáng)性菌株數(shù)量較多、陽(yáng)性率較高，且產(chǎn)NDM耐藥菌在醫(yī)院污水中廣泛存在。
　　3）人群分布及標(biāo)本來(lái)源分布特點(diǎn)：產(chǎn) NDM耐藥菌患者來(lái)源中，男性顯著多于女性，年齡低于10歲的兒童及大于60歲的老人顯著多于其他年齡段患者，推測(cè)男性兒童和老年人是感染產(chǎn)NDM耐藥菌的易感人群；呼吸內(nèi)科是 blaNDM基因陽(yáng)性菌檢出最多的科室，痰液標(biāo)本顯著多于糞便、血液和尿液等其他標(biāo)本，推測(cè)相比其他傳播方式，產(chǎn)NDM耐藥菌更易通過(guò)呼吸道感染和擴(kuò)散

7、。
　　4）基因型別特點(diǎn)：本研究發(fā)現(xiàn)blaNDM的四種基因型，包括blaNDM-1、blaNDM-3、blaNDM-5和 blaNDM-13。產(chǎn)NDM-1耐藥菌最多，產(chǎn) NDM-5耐藥菌次之，NDM-5為第二優(yōu)勢(shì)型別，且在北京、沈陽(yáng)、?？?、濟(jì)南、上海等多個(gè)城市均有發(fā)現(xiàn)，提示攜帶blaNDM-5基因菌株也已在中國(guó)廣泛傳播流行。
　　5）菌屬類別特點(diǎn)：產(chǎn) NDM耐藥菌中，不動(dòng)桿菌屬細(xì)菌數(shù)量最多，其次是肺炎克雷伯氏菌和大腸埃希氏菌

8、，近年來(lái)產(chǎn)NDM肺炎克雷伯氏菌和產(chǎn)NDM大腸埃希氏菌已在中國(guó)部分地區(qū)流行。首次發(fā)現(xiàn)1株產(chǎn)NDM-3耐藥大腸埃希氏菌和1株攜帶blaNDM-13基因腸炎沙門氏菌，且產(chǎn)NDM-1、NDM-3、NDM-5、NDM-13耐藥菌已蔓延至腸道病原菌。
　　2.利用ANI分析可成功鑒定不動(dòng)桿菌屬菌種。
　　首次利用ANI分析方法對(duì)產(chǎn)NDM耐藥不動(dòng)桿菌屬細(xì)菌進(jìn)行菌種鑒定，38株產(chǎn)NDM耐藥不動(dòng)桿菌屬細(xì)菌中，有5株托尼爾氏不動(dòng)桿菌被16S r

9、RNA誤鑒定為其他菌種，其中3株被鑒定為鮑氏不動(dòng)桿菌，1株瓊氏不動(dòng)桿菌和1株約氏不動(dòng)桿菌。
　　3. cgMLST對(duì)產(chǎn)NDM耐藥菌屬內(nèi)菌株親緣關(guān)系研究具有重要意義。
　　cgMLST聚類分析發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)NDM肺炎克雷伯氏菌和大腸埃希氏菌可能已在不同地區(qū)的人群中傳播，且產(chǎn)NDM托尼爾氏不動(dòng)桿菌和產(chǎn)NDM乙酸鈣不動(dòng)桿菌可能已在不同地區(qū)、不同來(lái)源中播散。本研究建立產(chǎn)NDM耐藥菌親緣關(guān)系研究的cgMLST實(shí)驗(yàn)方法，為產(chǎn)NDM耐藥菌監(jiān)測(cè)技

10、術(shù)平臺(tái)和分子分型數(shù)據(jù)庫(kù)建立打下了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。
　　4.中國(guó)部分地區(qū)產(chǎn)NDM耐藥菌耐藥譜廣，且不同型別、不同菌屬耐藥譜存在差異。
　　1）產(chǎn)NDM耐藥菌都是多重耐藥菌，多為泛耐藥菌，耐藥譜廣：77株產(chǎn)NDM耐藥菌均對(duì)3類以上抗生素耐藥，為多重耐藥菌。所有菌株對(duì)氨芐西林、頭孢唑林和頭孢曲松的耐藥率都高達(dá)100%，對(duì)頭孢他啶和頭孢吡肟?jī)煞N抗菌藥物的耐藥率都達(dá)到了98.7%，對(duì)哌拉西林亦是高水平耐藥，耐藥率為93.5%，對(duì)氨曲南的耐藥

11、率高達(dá)97.4%；所有菌株對(duì)碳青霉烯類的亞胺培南和美羅培南、硝基呋喃類的呋喃妥英、磺胺類的復(fù)方新諾明均表現(xiàn)高水平耐藥，只對(duì)氨基糖苷類的阿米卡星較為敏感，但耐藥率仍為24.7%。
　　2）產(chǎn)NDM-5菌株耐藥性高于產(chǎn)NDM-1耐藥菌：對(duì)不同型別產(chǎn)NDM耐藥菌的耐藥性進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)NDM-5菌株的耐藥率顯著高于產(chǎn)NDM-1菌株的耐藥率。
　　3）不同菌屬產(chǎn)NDM耐藥菌耐藥譜不同：對(duì)不同菌屬產(chǎn)NDM耐藥菌的耐藥性進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)不

12、同菌屬產(chǎn)NDM耐藥菌耐藥譜不同，不動(dòng)桿菌屬細(xì)菌對(duì)哌拉西林的耐藥率顯著低于其他菌屬，沙門氏菌屬細(xì)菌對(duì)阿米卡星、環(huán)丙沙星和左氧氟沙星均敏感，檸檬酸桿菌屬細(xì)菌僅對(duì)四環(huán)素敏感；埃希氏菌屬細(xì)菌僅對(duì)阿米卡星表現(xiàn)低水平耐藥。提示，產(chǎn)NDM耐藥菌感染治療與防控過(guò)程中，抗菌藥物的適當(dāng)調(diào)整與合理應(yīng)用尤為重要。
　　5.相比不動(dòng)桿菌，攜帶blaNDM基因的質(zhì)粒易在腸桿菌科細(xì)菌中傳播，且耐藥性更強(qiáng)。
　　1）blaNDM基因多通過(guò)質(zhì)粒在細(xì)菌屬內(nèi)及屬

13、間傳播：77株產(chǎn)NDM耐藥菌株的blaNDM-1基因進(jìn)行定位分析發(fā)現(xiàn)，所有菌株都含有2-5個(gè)質(zhì)粒，67株 blaNDM基因定位于質(zhì)粒上，10株blaNDM基因在染色體上。定位于30~50kb大小質(zhì)粒菌株最多，涵蓋多個(gè)菌種，可能有優(yōu)勢(shì)質(zhì)粒在腸桿菌科細(xì)菌及不動(dòng)桿菌屬細(xì)菌間傳播。11株菌2個(gè)質(zhì)粒同時(shí)含有blaNDM基因，耐藥譜相比其他產(chǎn)NDM耐藥菌較廣，推測(cè)多個(gè)含耐藥基因質(zhì)粒可能增強(qiáng)了菌株的耐藥性。耐藥基因在染色體上的產(chǎn)NDM耐藥菌多為不動(dòng)桿

14、菌屬細(xì)菌。
　　2）腸桿菌科細(xì)菌比不動(dòng)桿菌的blaNDM基因更易發(fā)生水平轉(zhuǎn)移：67株blaNDM基因定位于質(zhì)粒的產(chǎn)NDM耐藥菌進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)，49株成功將含blaNDM基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)移至受體菌J53中，未發(fā)生接合轉(zhuǎn)移菌株中，18株均為不動(dòng)桿菌屬細(xì)菌。
　　3）腸桿菌科細(xì)菌blaNDM陽(yáng)性接合子耐藥性強(qiáng)于不動(dòng)桿菌：對(duì)含blaNDM-1基因陽(yáng)性接合菌耐藥情況進(jìn)行評(píng)估發(fā)現(xiàn)，所有腸桿菌科菌株具備原始供體菌典型的耐藥性，均對(duì)青霉素類、頭

15、孢菌素類和碳青霉烯類抗生素表現(xiàn)出耐藥，而多數(shù)不動(dòng)菌屬細(xì)菌含blaNDM-1基因接合子雖獲得了質(zhì)粒，但卻沒(méi)有獲得相應(yīng)對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥表型，僅對(duì)頭孢菌素類表現(xiàn)為耐藥，不具備原始供體菌典型的耐藥性。
　　6.似Tn125轉(zhuǎn)座結(jié)構(gòu)在blaNDM基因傳播過(guò)程中起著重要作用，中國(guó)存在產(chǎn)NDM耐藥菌引發(fā)嚴(yán)重公共衛(wèi)生問(wèn)題風(fēng)險(xiǎn)。
　　1）blaNDM基因通過(guò)似Tn125轉(zhuǎn)座結(jié)構(gòu)，在細(xì)菌屬內(nèi)及屬間傳播：選取17株不同菌屬、blaNDM

16、-1基因不同位置（質(zhì)粒及染色體）代表菌株，利用菌株二代全基因組測(cè)序方法，對(duì)其blaNDM-1基因周邊結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，17株產(chǎn)NDM耐藥菌分7種不同型別似Tn125轉(zhuǎn)座結(jié)構(gòu)，均與pNDM-BJ01的完整Tn125結(jié)構(gòu)不同。
　　2）ISAba125轉(zhuǎn)座酶不是blaNDM基因傳播的必需酶：首次發(fā)現(xiàn)2株Tn125上下游ISAba125轉(zhuǎn)座酶同時(shí)發(fā)生丟失的菌株，分別為魯氏不動(dòng)桿菌和托尼爾氏不動(dòng)桿菌；之前報(bào)道在blaNDM-1基因傳播過(guò)程

17、中發(fā)揮重要作用的ISAba125轉(zhuǎn)座酶發(fā)生丟失，由此推斷，ISAba125轉(zhuǎn)座酶不是blaNDM基因傳播的必需酶。
　　3）中國(guó)攜帶blaNDM基因菌株源于不動(dòng)桿菌：結(jié)合上述研究和國(guó)內(nèi)外相關(guān)報(bào)道，及blaNDM-1基因定位于染色體多為不動(dòng)桿菌屬細(xì)菌這一現(xiàn)象，推測(cè)blaNDM-1基因在中國(guó)最早來(lái)源于不動(dòng)桿菌，blaNDM-1基因多嵌合于不動(dòng)桿菌屬細(xì)菌染色體上，Tn125或似Tn125轉(zhuǎn)座結(jié)構(gòu)在介導(dǎo)blaNDM-1在不動(dòng)桿菌屬細(xì)菌屬內(nèi)

18、傳播的同時(shí)，轉(zhuǎn)移至克雷伯氏菌、埃希氏菌、沙門氏菌等腸桿菌科細(xì)菌中。
　　4）中國(guó)存在產(chǎn)NDM耐藥菌引發(fā)嚴(yán)重公共衛(wèi)生問(wèn)題風(fēng)險(xiǎn)：結(jié)合接合轉(zhuǎn)移及陽(yáng)性接合子耐藥實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不動(dòng)桿菌的blaNDM-1基因相比腸桿菌科細(xì)菌，不易通過(guò)基因水平轉(zhuǎn)移至其他菌株，這可能也是中國(guó)到目前為止，未發(fā)生產(chǎn)NDM耐藥菌引發(fā)嚴(yán)重公共衛(wèi)生問(wèn)題的原因。但腸桿菌科細(xì)菌的blaNDM-1基因基本都位于質(zhì)粒上，且接合轉(zhuǎn)移后對(duì)碳青霉烯類高水平耐藥。隨著產(chǎn)NDM腸桿菌科細(xì)菌逐年

19、增多，中國(guó)有產(chǎn)NDM耐藥菌引發(fā)嚴(yán)重公共衛(wèi)生問(wèn)題的風(fēng)險(xiǎn)，而blaNDM基因傳播過(guò)程所需關(guān)鍵調(diào)控因子有待深入研究。
　　綜上所述，本研究通過(guò)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)研究，獲得產(chǎn)NDM耐藥菌感染發(fā)生率和耐藥現(xiàn)狀，發(fā)現(xiàn)不同型別、不同菌屬產(chǎn)NDM耐藥菌在中國(guó)部分地區(qū)流行播散；我國(guó)產(chǎn)NDM耐藥菌耐藥譜廣，且不同型別、不同菌屬耐藥譜存在差異，這些結(jié)果為臨床治療產(chǎn)NDM耐藥菌引起的重癥感染，制訂科學(xué)、有效的預(yù)防和控制措施提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。進(jìn)一步對(duì)中國(guó)部分

20、地區(qū)產(chǎn)NDM耐藥細(xì)菌進(jìn)行遺傳多態(tài)性、基因定位及轉(zhuǎn)移特性、blaNDM基因周邊結(jié)構(gòu)等研究，初步闡明了blaNDM-1基因在中國(guó)最早來(lái)源于不動(dòng)桿菌，在屬內(nèi)傳播的同時(shí)，轉(zhuǎn)移至克雷伯氏菌、埃希氏菌、沙門氏菌等腸桿菌科細(xì)菌中。而產(chǎn)NDM耐藥腸桿菌科細(xì)菌比產(chǎn)NDM耐藥不動(dòng)桿菌的blaNDM基因更易發(fā)生基因水平轉(zhuǎn)移，且轉(zhuǎn)移后具備供體菌典型的碳青霉烯類抗菌藥物耐藥性。隨著被報(bào)道產(chǎn)NDM腸桿菌科細(xì)菌數(shù)目逐年增加，推測(cè)中國(guó)存在產(chǎn)NDM耐藥菌引發(fā)嚴(yán)重公共衛(wèi)生