谷胱甘肽存在下鉑類配合物與DNA作用機制研究.pdf

1、自20世紀70年代Rosenberg發(fā)現順鉑具有抗細胞增殖活性以來，順鉑一直是腫瘤化學療法中最為有效的藥物之一。然而順鉑存在著水溶性差，毒副作用大和耐藥性等缺陷，在一定程度上限制了其應用，為了克服這些不足，人們設計開發(fā)了許多種類的鉑類配合物，包括修飾其離去基團的卡鉑類配合物，修飾載體配體的奧沙利鉑類配合物，以及在軸向位置上進行修飾的鉑(Ⅳ）類配合物。基于對鉑類配合物作用機理和耐藥機制的不斷深入研究，鉑類藥物被發(fā)現在進入體內之后，會與許多

2、含硫生物分子發(fā)生相互作用，這些相互作用會影響鉑藥的吸收、轉運、藥效和排出等多方面生理過程。還原性谷胱甘肽是細胞內普遍存在的含硫生物分子，在機體防御體系中起著重要作用，能與外源物質或重金屬離子結合形成復合物，從而起到解毒的作用。由于谷胱甘肽含有巰基、氨基、羧酸、酰胺等多種配位基團，是研究生物分子與鉑類配合物之間相互作用較理想的模型。研究DNA和含硫生物分子與鉑配合物的相互作用對于探索鉑類化合物在體內生理功能和毒性機理有重要意義。
　

3、　本研究主要內容包括：⑴以奧沙利鉑為研究對象，使用液質聯用方法，分別檢測了奧沙利鉑與鳥苷酸、谷胱甘肽的結合產物，共確認了9個反應產物。其中，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ、Ⅷ和Ⅸ為首次報道的反應產物，產物Ⅱ、Ⅲ、Ⅷ和Ⅸ為反應中間體，對產物Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ進行了定性定量測定。通過實驗發(fā)現，奧沙利鉑較順鉑而言，其1，2-環(huán)己二胺配體基團是穩(wěn)定的，沒有發(fā)生如順鉑的氨基配體被取代的現象。奧沙利鉑與DNA的結合產物以雙功能加合為主，其單功能加合產物為反應中間體

4、。奧沙利鉑與DNA的結合產物并不穩(wěn)定，能夠繼續(xù)被親核試劑谷胱甘肽所取代。谷胱甘肽能夠與奧沙利鉑形成雙結合產物Ⅶ，該產物能夠向橋環(huán)產物Ⅴ轉化。研究表明谷胱甘肽參與奧沙利鉑與鳥苷酸的反應主要通過兩種方式進行，一是與鳥苷酸競爭消耗活性鉑配合物，二是取代結合在鉑單元上的鳥苷酸分子。⑵選擇課題組前期研究的具有較好抗腫瘤活性的橋環(huán)鉑(Ⅱ）配合物2a為研究對象，利用HPLC-MS方法，研究了該位阻型化合物與DNA和谷胱甘肽的作用機制。研究結果表明橋環(huán)

5、二胺配體雖然不能夠阻止谷胱甘肽與鳥苷酸共結合到鉑單元上，但能夠明顯抑制谷胱甘肽對鳥苷酸的取代反應。由于橋環(huán)二胺的位阻效應，谷胱甘肽對鳥苷酸的取代活性被降低。位阻基團的引入不僅降低了鉑配合物與谷胱甘肽的反應活性，而且增加了鉑與DNA加合物的穩(wěn)定性。⑶設計和合成了以(1R，2R)-B1-甲氧基芐基-1，2-環(huán)己二胺為配體的15個具有空間位阻的鉑(Ⅱ)配合物。采用MTT方法對合成的鉑(Ⅱ)類配合物進行了初步體外細胞毒活性研究，當離去基團為氯離

6、子時，配合物1-3的細胞毒活性優(yōu)于或相當于順鉑和奧沙利鉑。利用人胃癌細胞SGC7901和順鉑耐藥細胞SGC7901/CCDP考察時發(fā)現，配合物1-3的耐藥指數在0.59-0.91范圍內，具有克服順鉑耐藥的潛力。鑒于配合物1在體外細胞毒活性研究中表現出的優(yōu)勢，對該配合物進行了其它生物實驗的研究，包括:凝膠電泳、細胞攝取、細胞周期、細胞凋亡和Western blot測試。研究表明配合物1在與DNA的作用強度以及細胞攝取量上要明顯弱于其先導化

7、合物——奧沙利鉑。誘導細胞凋亡的通路與其先導化合物一致，是內源性線粒體通路，但誘導凋亡能力要弱于順鉑，略強于奧沙利鉑。⑷利用HPLC-MS技術，研究了配合物1與鳥苷酸的相互作用，結果表明配合物1以單功能加合物為主要產物，與位阻型配合物2a以及其母體化合物奧沙利鉑等雙功能配合物有顯著的差別，解釋了凝膠電泳實驗中配合物1與DNA的作用強度最弱的情況。研究了在含硫生物分子存在下，配合物1與鳥苷酸的相互作用。實驗數據表明配合物1與DNA的結合十

8、分穩(wěn)定，而在相同情況下，奧沙利鉑存在產物之間的相互轉換，從而彌補了配合物1細胞攝取低的缺陷，使其具有較強的細胞毒活性。⑸針對鉑(Ⅳ)類配合物的研究主要包括:配合物結構對其水溶液的穩(wěn)定性、與DNA的相互作用和氧化還原反應的影響。在水溶液的穩(wěn)定性方面，平面結構的載體基團對鉑(Ⅳ)配合物影響較大，氨基為配體的化合物比反式1，2-環(huán)己二胺的穩(wěn)定性弱;離去基團對其水溶液穩(wěn)定性影響不大;軸向配體對其水溶液的穩(wěn)定性影響最大。在與生物分子的相互作用方面