棉花多胺氧化酶GhPAOs基因的克隆及初步功能分析.pdf

1、目的：棉花是重要的經濟作物，其中陸地棉產量占全世界棉花總產量的90％左右。我國是世界上最大的棉花消費國，并且新疆是我國的植棉大省，2014年新疆種植面積和產量占到全國的46.3%和59.7%。眾所周知，低溫、鹽漬化、干旱等非生物脅迫影響植物的生長發(fā)育，新疆棉花種植表現尤為突出。研究發(fā)現，植物體內多胺與抗逆也有密切的關系，多胺氧化酶（PAO）作為多胺氧化降解途徑中的一個關鍵酶,氧化多胺產生H2O2，H2O2與植物的生長發(fā)育相關，尤其與非生

2、物脅迫有密切的關系。本實驗通過對陸地棉PAO基因進行克隆和功能分析，為研究多胺參與抗逆研究提供重要理論依據，也為利用基因工程手段進行棉花遺傳改良提供參考。
　　方法：（1）利用同源序列法，結合雷蒙德氏棉基因組信息，以陸地棉cDNA為模版，克隆獲得GhPAO1/2/3基因。（2）利用qRT-PCR技術分析棉花不同組織和不同處理條件下的表達特性。（3）利用Gateway技術構建PGWB17-GhPAO1/2/3過表達載體，分別轉化擬南

3、芥和棉花。（4）通過HPLC方法測定野生型和轉PGWB17-GhPAO1擬南芥中多胺含量的變化。（5）通過DAB顯色試劑盒和H2O2測試試劑盒測定野生型和轉PGWB17-GhPAO1擬南芥中H2O2含量的變化。
　　結果與結論：1.以擬南芥AtPAO1、AtPAO2和AtPAO5的cDNA序列為探針，在雷蒙德氏棉數據庫中Blastn比對獲得同源PAO基因，設計特異性引物并利用RT-PCR技術克隆獲得3個陸地棉PAO基因，命名為Gh

4、PAO1、GhPAO2和GhPAO3。對GhPAO1、GhPAO2和GhPAO3的cDNA進行生物信息學分析，結果顯示該基因cDNA全長分別為1751 bp、2237 bp和1736 bp，開放閱讀框分別為1483 bp、1473 bp和1530 bp，分別編碼493、490和506個氨基酸，預測蛋白大小分別為55.3709KD、54.405 kD和56.88 kD，等電點都為5.31、5.69和5.77，編碼蛋白均為親水性蛋白。聚類分

5、析將其分為三類，棉花GhPAO1基因與可可樹TcPAO1、葡萄VvPAO1和擬南芥AtPAO1聚為一類；棉花GhPAO2基因與可可樹TcPAO2、葡萄VvPAO2、擬南芥AtPAO2、AtPAO3、煙草NtPAO2以及蘋果MdPAO2等聚為一類，棉花GhPAO3與可可樹TcPAO5、葡萄VvPAO5、擬南芥AtPAO5聚為一類。通過Real-time PCR對GhPAO1、GhPAO2和GhPAO3基因在不同組織和多種非生物脅迫處理的表

6、達情況進行分析，結果表明它們在不同組織中的表達情況不同，GhPAO1基因在棉花莖中表達最高， GhPAO2基因主要在棉花花瓣和葉中表達，GhPAO3基因在棉花葉中的表達最高。不同脅迫處理條件下GhPAO1、GhPAO2和GhPAO3基因表達量都發(fā)生顯著變化，其中GhPAO1基因在ABA處理和低溫處理后基因表達量迅速上升并在1 h時表達量達到最高。GhPAO2基因在20%PEG處理和低溫處理后基因表達量迅速上升并在1 h時表達量達到最高，

7、200 mmol?L-1NaCl和1mmol ABA處理則在24 h時表達量達到最高。GhPAO3在低溫處理和ABA處理后該基因在6 h時表達量達到最大值，PEG處理后在24 h時表達量達到最大值，NaCl則在處理后3 h時表達量最高。上述結果表明GhPAO1、GhPAO2和GhPAO3基因受非生物脅迫誘導表達，可能以不同的角色參與了棉花抗逆過程。
　　2.構建超表達載體PGWB17-GhPAO1/2/3，將構建的載體轉化模式植物

8、擬南芥，T1代進行PCR驗證抗性擬南芥，繼續(xù)篩選，GhPAO1獲得轉基因的純合體，并進行qRT-PCR分析，選擇表達量高的陽性株系進行后續(xù)研究。（1）多胺含量測定表明，轉基因株系中多胺（PAs）總含量降低，Put的含量增加，Spd和Spm的含量降低。DAB顯色結果表明，轉基因中H2O2含量增加。因此，我們推測GhPAO1基因在擬南芥中超表達后，可能參與了Spd和Spm的降解，產生更多的H2O2。（2）外源多胺和抑制劑處理擬南芥結果顯示，

9、外源多胺和PAO抑制劑（1,8-DO）能夠促進擬南芥子葉變綠，而多胺抑制劑（D-Arg）抑制擬南芥子葉變綠。通過對不同處理下野生型和轉基因后代的H2O2含量分析表明，外源多胺處理時超表達GhPAO1基因可能通過氧化多胺造成H2O2含量增加，進而對擬南芥綠色子葉產生影響。（3）NaCl及NaCl同時附加外源多胺處理下，GhPAO1轉基因擬南芥的綠色子葉率低于野生型，而轉基因擬南芥中H2O2含量高于野生型，推測H2O2的產生抑制了擬南芥的綠

10、色子葉。同時，用300 mmol NaCl處理野生型和GhPAO1轉基因擬南芥幼苗，結果顯示，處理36 h后野生型擬南芥葉片出現卷曲和失水，甚至開始變黃，而轉基因株系葉片比較平展，失水較少。高效液相色譜分析300 mmol NaCl處理下野生型和轉基因株系的PAs含量，發(fā)現轉基因株系中多胺含量低于野生型。
　　3.將已構建的植物表達載體PGWB17-GhPAO1/2/3通過農桿菌介導法侵染棉花YZ-1下胚軸，繼代獲得胚性愈傷，提取