以天然神經(jīng)細胞外基質(zhì)為支架構(gòu)建組織工程神經(jīng)修復周圍神經(jīng)缺損.pdf

1、隨著現(xiàn)代社會的發(fā)展,事故傷害、戰(zhàn)爭、地震、腫瘤手術(shù)等導致神經(jīng)損傷的人數(shù)逐年增加。我國周圍神經(jīng)損傷病例每年新增60～90萬例,需要通過神經(jīng)移植來修復神經(jīng)的病例約為30萬～45萬例,若治療不當造成終身殘疾,導致嚴重經(jīng)濟負擔和社會負擔。目前治療周圍神經(jīng)損傷的“金標準”是自體神經(jīng)移植,但其受到供區(qū)神經(jīng)來源不足,繼發(fā)的供區(qū)神經(jīng)功能喪失,以及供區(qū)神經(jīng)結(jié)構(gòu)和尺寸上不匹配等限制。因此,研發(fā)能夠有效代替自體神經(jīng)的移植替代物是國內(nèi)外研究的熱點。組織工程的發(fā)

2、展為修復周圍神經(jīng)缺損提供了新的方法。組織工程神經(jīng)由支架材料、種子細胞及生長因子三個要素組成,還應具備組成成份和空間結(jié)構(gòu)雙重仿生。神經(jīng)來源細胞外基質(zhì)(Extracellular Matrix,ECM)不僅為細胞提供了支持結(jié)構(gòu)和附著位點,而且本身包含許多生物信息,能夠提供細胞所需的信號,對細胞的粘附、遷移、增殖、分化及基因的表達調(diào)控有重要作用和顯著影響,對神經(jīng)再生有明顯的引導和促進作用。然而,目前商業(yè)化神經(jīng)再生導管材料中,采用的是豬或牛的Ⅰ

3、、Ⅲ型膠原。這些材料只利用了細胞外基質(zhì)的一部分,如何更好地保留ECM的主要成分并更好的構(gòu)建組織工程神經(jīng)成為研究熱點。
　　 目的：研究如何更好地構(gòu)建組織工程神經(jīng)并評價修復效果,即制備具有組成成分和結(jié)構(gòu)仿生的天然神經(jīng)ECM組織工程神經(jīng)支架,同時復合具有促神經(jīng)生長、低免疫原性的種子細胞構(gòu)建組織工程神經(jīng),評價其修復周圍神經(jīng)缺損效果。
　　 方法：⑴采用低滲凍融、機械粉碎、差速離心法制備神經(jīng)細胞外基質(zhì)。對其形態(tài)特征,免疫熒光染色

4、觀察組成成分,接種雪旺細胞或背根神經(jīng)節(jié)評價細胞外基質(zhì)生物相容性；⑵定向結(jié)晶技術(shù)制備取向性神經(jīng)源性ECM支架；生物力學測試儀測試神經(jīng)源性ECM支架力學特性；并通過測量軸突神經(jīng)距離評價修復周圍神經(jīng)缺損短期效果；⑶體外誘導大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)、脂肪干細胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)和人臍帶Wharton間充質(zhì)干細胞向雪旺細胞分化,免疫

5、熒光染色鑒定表型特征；Dead/live染色檢測生物蛋白膠中BMSCs存活情況及ELISA檢測神經(jīng)營養(yǎng)因子；不同數(shù)量的BMSCs生物蛋白膠復合物對背根神經(jīng)節(jié)軸突生長長度、雪旺細胞遷移距離和軸突面積指數(shù)進行定量評價；⑷采用不同方法分別在化學去細胞異體神經(jīng)(chemical extracted acellular nerveallograft,CEANA)內(nèi)部和周圍添加添加類雪旺細胞,通過肢體功能評估和組織學檢測的方法評價不同添加方法及添加

6、不同細胞促CEANA神經(jīng)再生的效果。
　　 結(jié)果：①神經(jīng)細胞外基質(zhì)為直徑30～130 nm的納米微絲。Ⅰ型膠原、層粘蛋白、纖連蛋白染色陽性；大鼠背根神經(jīng)節(jié)、雪旺細胞在神經(jīng)細胞外基質(zhì)上生長良好。②神經(jīng)源性ECM取向支架橫截面呈多孔蜂窩狀結(jié)構(gòu),縱截面孔道呈平行排列的管道結(jié)構(gòu)；ECM取向支架、CEANA破裂強度、極限應力、極限應變及斷裂功耗同正常神經(jīng)相比,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),CEANA同正常神經(jīng)相比彈性模量無差異,而E

7、CM取向支架彈性模量小于CEANA彈性模量(P<0.05),。ECM取向支架修復周圍神經(jīng)缺損軸突生長長度小于CEANA(P<0.05)。③向雪旺細胞方向誘導的大鼠BMSCs、ADSCs和人臍帶Wharton間充質(zhì)干細胞形態(tài)與雪旺細胞相似；免疫熒光染色p75和GFAP陽性。BMSCs生物蛋白膠復合物同大鼠背根神經(jīng)節(jié)(Dorsal root ganglion,DRG)共培養(yǎng)組,軸突生長長度、雪旺細胞遷移距離和軸突面積指數(shù)明顯大于空白對照組(

8、P<0.05)。④CEANA復合dADSC、dMSC和SCs均可提高小腿三頭肌收縮力和小腿三頭肌濕重恢復率。CEANA復合dADSC、dMSC和SC可使坐骨神經(jīng)有髓纖維數(shù)增多和髓鞘厚度增加。CEANA內(nèi)、外添加MSCs生物蛋白膠復合物對周圍神經(jīng)損傷修復,在功能評價和組織學評價具有類似的結(jié)果。
　　 結(jié)論：⑴制備的神經(jīng)源性ECM保留了天然神經(jīng)基質(zhì)源性成分,具有良好的細胞相容性；⑵利用定向結(jié)晶技術(shù)制備出神經(jīng)源性ECM取向性支架；神經(jīng)

9、源性ECM取向性支架力學特性有待進一步提高,而去細胞異體神經(jīng)生物力學抗拉強度可滿足神經(jīng)移植材料力學特性要求；體內(nèi)實驗證實神經(jīng)源性ECM取向性具有良好的生物相容性,但周圍神經(jīng)損傷短期修復效果低于CEANA；體外培養(yǎng)證實去細胞異體神經(jīng)具有組成成份、管孔結(jié)構(gòu)和管壁纖維取向排列的多重仿生,是理想的組織工程神經(jīng)支架；⑶大鼠BMSCs、ADSCs和人臍帶Wharton間充質(zhì)干細胞可誘導分化成類雪旺細胞,其形態(tài)和表型特征與雪旺細胞相似；BMSCs在生