兔脂肪來源干細胞分離培養(yǎng)及富血小板血漿對其增殖的影響.pdf

1、背景：自體脂肪移植已有上百年的歷史，因其來源豐富、取材容易、操作簡單、充盈外形好、無排異反應等優(yōu)點，倍受整形美容外科醫(yī)生的重視，但同時也存在不足之處，其中最主要是移植后脂肪細胞的成活率較低(＜60％)。如何提高脂肪細胞的增殖及分化能力，是提高移植成活率的重要環(huán)節(jié)。隨著脂肪組織工程的發(fā)展及研究，尋求來源廣、易獲取、損傷小、穩(wěn)定擴增的種子細胞和無免疫反應、高效、廉價、配比協(xié)同作用好的生長因子是關鍵問題。
　　 目的：分離培養(yǎng)兔脂肪來

2、源干細胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)，并觀察ADSCs體外生長的生物學特性及增殖分化潛能，探討自體富血小板血漿(platelet-rich plasma，PRP)對ADSCs增殖的影響。
　　 方法：1．實驗采用新西蘭大白兔，取兔頸背部區(qū)脂肪墊，貼壁法及Ⅰ型膠原酶消化法體外培養(yǎng)兔ADSCs，觀察其形態(tài)特征。
　　 2．取第3代ADSCs進行成脂、成骨誘導分化，兩周后油紅0成脂染色及

3、三周后茜素紅成骨染色鑒定。
　　 3．抽取兔心臟血，采用二次離心法制備PRP，并行全血及PRP血小板計數。
　　 4．將第3代細胞分為對照組(細胞180ul+單純DMEM培養(yǎng)基20ul)、全血組(細胞180ul+全血血漿20ul)和PRP組(細胞180ul+PRP20ul)，采用CCK-8法(Cell Counting Kit-8)檢測不同作用時間(24h、48h、72h)各組對ADSCs增殖活動的影響。
　　

4、結果：1．原代培養(yǎng)的細胞24h后見少量橢圓形細胞貼壁，大部分未貼壁細胞為圓形的紅細胞及筋膜雜質。48h首次換液，除去未貼壁的紅細胞及筋膜雜質，見小部分貼壁細胞呈短梭形，其間也可見三角形、多角形細胞。3d后見部分細胞已貼壁伸展，呈長梭形，可見核分裂相，梭形細胞逐漸增多。7d后見細胞80%-90%融合，細胞呈漩渦樣生長，大小不一，細胞多為長梭形成纖維細胞樣。傳代細胞4-6h即可貼壁，細胞形態(tài)與原代相似，細胞生長速度較原代細胞明顯增快。

5、>　　 2．細胞成脂誘導兩周后油紅0染色呈陽性，對照組為陰性；細胞成骨誘導三周后茜素紅染色呈陽性，對照組為陰性。
　　 3．全血血小板計數為(313.0±137.5)×109/L，PRP血小板計數為(1267.0±760.2)×109/L，PRP血小板計數是全血的4.08倍。
　　 4．CCK-8法顯示PRP組在24h、48h、72h時較對照組增殖明顯(P＜0.01)。且在第24h、48h、72h時，與全血組有統(tǒng)計學差

6、異(P＜0.05)。
　　 結論：1．通過膠原酶消化法從兔頸背部區(qū)提取的脂肪組織分離得到的細胞，經鑒定證實為ADSCs。采用這種方法獲得的細胞增殖迅速，可長期傳代并維持穩(wěn)定的增殖能力。
　　 2．ADSCs具有多向分化潛能，在特定條件下能夠向成骨細胞、脂肪細胞方向誘導分化，可作為組織工程的種子細胞。
　　 3．通過二次離心成功提取兔PRP，血小板計數后，PRP的血小板計數控制在全血的4倍以上，二次離心法是制備PR