牛病毒性腹瀉病毒持續(xù)性感染的分子機制研究及其定點突變株的構建.pdf

1、牛病毒性腹瀉病毒（bovine viral diarrhea virus，BVDV）是造成豬、牛、羊和鹿等家畜動物和部分野生動物的牛病毒性腹瀉-黏膜?。╞ovine viral diarrhea-mucosal disease，BVD-MD）的主要病原體。該病毒在全球范圍內廣泛傳播，對畜牧業(yè)的健康發(fā)展和牛源生物制品（血清和凍精等）質量提高等造成巨大的威脅。但是，目前我國尚無有效的藥物和防控措施抵御 BVDV感染，其主要原因之一是 BVD

2、V持續(xù)性感染的分子機制尚未系統(tǒng)闡明。而大量的研究表明細胞自噬和凋亡等信號通路直接影響病毒持續(xù)性感染，而且 microRNA（miRNA）也能通過調控細胞自噬和凋亡等信號通路進而影響病毒持續(xù)性感染，所以本研究全面探索 BVDV、miRNA、自噬和凋亡之間相互作用的分子機制，為闡明 BVDV持續(xù)性感染的分子機制提供理論依據；同時通過定點突變和反向遺傳學技術構建 BVDV定點突變株，為研發(fā)抗 BVDV有效方法奠定了技術和理論支持，也為家畜的抗

3、病育種工作提供新的方法和理論依據。
　　目的：本研究以 BVDV標準株 NADL為研究對象，探索 BVDV NADL調控宿主細胞 MDBK的細胞自噬和凋亡通路及自噬改變對 BVDV NADL復制影響的分子機制，并探索利用反向遺傳學技術構建定點突變性 BVDV毒株。（1）探索 BVDV NADL影響 MDBK細胞自噬的分子機制；（2）探討 MDBK細胞自噬水平改變后對 BVDV復制的影響；（3）探究 miR-29b對 BVDV NA

4、DL感染誘導的細胞自噬及 BVDV NADL復制的影響；（4）分析 miR-29b對 MDBK細胞凋亡的影響；（5）使用反向遺傳學技術拯救定點突變型 BVDV毒株。通過本研究的開展，為系統(tǒng)闡述 BVDV持續(xù)性感染的分子機制、開發(fā)防控 BVDV的新方法和家畜的抗病育種工作奠定理論依據。
　　方法：（1）BVDV NADL感染 GFP-LC3質粒轉染的 MDBK細胞，在處理后不同時間，采用實時定量 PCR、Western blot、激

5、光共聚焦顯微鏡和透射電鏡等方法檢測細胞自噬相關蛋白表達水平和自噬活性變化；并構建紅色熒光標記的 BVDV NADL三個糖蛋白 Erns、E1和 E2基因過表達的慢病毒，使用相同方法檢測糖蛋白過表達對細胞自噬活性的影響；（2）使用自噬抑制劑、促進劑和 RNA干擾技術分別處理 MDBK細胞，檢測細胞自噬水平的變化；并使用 BVDV NADL感染自噬活性改變的 MDBK細胞，檢測 BVDV NADL mRNA水平變化；（3）預測并鑒定 miR

6、-29b在自噬信號通路中靶基因 ATG14和 ATG9A；檢測 pre-miR-29b過表達的慢病毒和 BVDV NADL感染后靶蛋白表達水平、細胞自噬水平及 BVDV NADL復制水平；并設計 ATG14和 ATG9A回補實驗，進一步驗證 miR-29b通過下調靶蛋白 ATG14和 ATG9A的表達，進而影響B(tài)VDV NADL感染誘導的細胞自噬水平和 BVDV的復制；（4）預測和鑒定 miR-29b在凋亡信號通路中的靶基因 NAIF1

7、和 caspase-7；檢測 miR-29b模擬物和抑制劑轉染后 MDBK細胞凋亡水平及 caspase-7和 NAIF1 mRNA和蛋白表達水平；并設計caspase-7和 NAIF1回補實驗，進一步證明 miR-29b通過下調 caspase-7和 NAIF1的表達，進而影響凋亡水平；（5）構建 T7 RNA聚合酶基因過表達的慢病毒，并感染 MDBK細胞；使用嘌呤霉素進行穩(wěn)定表達篩選；檢測 T7RNAP表達水平和 T7 RNA聚合酶

8、活性；傳至40代，鑒定 MDBK-T7RNAP細胞的穩(wěn)定性；并以 pACNR/NADL質粒為模板，使用定點突變試劑盒突變 E2和 NS4B基因位點；轉染突變質粒至 MDBK-T7RNAP細胞中，拯救定點突變株，并檢測 BVDV定點突變株復制水平的變化；并傳代鑒定其遺傳穩(wěn)定性。
　　結果：（1）BVDV NADL感染及 Erns和 E2過表達都能顯著性增加自噬體/自噬溶酶體的數量、GFP-LC3 puncta數量、Beclin1和

9、ATG14 mRNA和蛋白水平；（2）3-MA、渥曼青霉素和 RNA干擾能抑制細胞自噬活性和 BVDV NADL的復制；相反地，rapamycin處理能顯著性促進細胞自噬和增加 BVDV NADL復制；當 BVDV NADL感染18 h后，5’UTR轉錄水平出現降低，加入溶酶體抑制劑氯喹，其轉錄水平又出現升高；（3）miR-29b能特異性靶向 ATG14和 ATG9A的3’UTR區(qū)并抑制其表達；同時miR-29b高表達能顯著性降低 BV

10、DV NADL的復制水平及其感染誘導的細胞自噬；ATG14和 ATG9A表達回復后，BVDV NADL復制水平和 BVDV NADL感染誘導的細胞自噬水平又出現升高；（4）miR-29b降低了 MDBK細胞凋亡水平；miR-29b能直接靶向 NAIF1和 caspase-73’UTR并抑制其表達；NAIF1和 caspase-7過表達后顯著性增加細胞凋亡水平；（5）成功篩選獲得具有較強的 T7 RNA聚合酶活性和較好穩(wěn)定性的MDBK-T

11、7RNAP細胞；并成功構建 E2和 NS4B突變的 BVDV毒株 BVDV E2M和NS4BM；與親本株相比，BVDV E2M和 NS4BM mRNA復制水能力和增殖能力有所下降。
　　結論：（1）BVDV NADL感染及 Erns和 E2過表達能顯著性增加細胞自噬的活性，首次闡明 BVDV感染對自噬的影響及其分子機制；（2）細胞自噬水平下降后阻止了BVDV NADL復制；早期自噬水平上調后增加了 BVDV NADL的復制；闡述了

12、自噬改變對 BVDV復制的影響，也進一步為闡明 BVDV持續(xù)性感染的分子機制奠定理論依據；（3）miR-29b直接靶向自噬相關蛋白 ATG14和 ATG9A并抑制其表達，進而抑制BVDV NADL感染誘導的細胞自噬和 BVDV NADL復制，闡明了 miR-29b通過影響自噬進而影響 BVDV復制的分子機制；（4）miR-29b直接靶向凋亡相關蛋白 caspase-7和 NAIF1并抑制其表達，進而降低 MDBK細胞凋亡水平，闡明 mi