雙氫青蒿素二聚體的合成、抗瘧活性及體內代謝初步研究.pdf

1、目的：
　　合成雙氫青蒿素二聚體（以下簡稱二聚體），確定其絕對構型；考察二聚體在體外各環(huán)境中的穩(wěn)定性及主要降解產物；測定二聚體的平衡溶解度和表觀油水分配系數(shù)；考察二聚體對惡性瘧原蟲3D7株的體外抗瘧活性；建立約氏瘧鼠模型，考察二聚體對約氏鼠瘧的體內抗瘧活性；初步研究二聚體在大鼠體內的可能代謝產物及主要代謝途徑。
　　方法：
　　1.二聚體的合成及理化表征
　　以雙氫青蒿素(Dihydroartemisinin，

2、DHA）為原料藥，三氟化硼乙醚（BF3 Et3O）為催化劑，通過醚化反應合成二聚體。經高效液相色譜串聯(lián)質譜（LC-MS/MS）法測定，采用面積歸一化法計算其純度。并以高分辨質譜（HR-MS）法、核磁共振氫譜（1H-NMR）法對其結構進行鑒定。在室溫條件下用石油醚對其重結晶后，培養(yǎng)單晶體，采用單晶X射線衍射（SXRD）確定其絕對構型。建立LC-MS/MS法，考察二聚體在pH1.2～8.0緩沖液、血漿和培養(yǎng)基中（37℃孵育24 h）的穩(wěn)定性

3、；測定二聚體在pH4.0～8.0緩沖液中的平衡溶解度和在正辛醇-水/磷酸緩沖鹽中的表觀油水分配系數(shù)。此外，采用高效液相-高分辨質譜聯(lián)用（HPLC-HRMS）法鑒定二聚體在pH1.2緩沖液中的降解產物。
　　2.二聚體的體外抗瘧活性考察
　　以惡性瘧原蟲3D7株為模型，經山梨醇同步化法同步瘧原蟲生長周期，以DHA為陽性對照組，采用SYBR GreenⅠ法測定不同濃度的二聚體對瘧原蟲增殖的抑制情況。并以 IC50（50％抑制濃度

4、）和 IC95（95%抑制濃度）評價藥物的體外抗瘧活性。
　　3.二聚體的體內藥效學研究
　　以約氏瘧鼠為模型，采用皮爾遜四天抑制法分別經灌胃、尾靜脈注射途徑給予不同劑量的二聚體，以DHA為陽性對照組。停藥1 d后，取血、鏡檢，計算其感染率、抑制率、ED50（50%有效劑量）、ED90（90%有效劑量）和轉陰率。停藥1周后，再次取血、鏡檢，計算并比較各劑量組間感染率。停藥一個月，比較各組間的復燃率、治愈率、死亡率、平均存活天

5、數(shù)，并觀察存活鼠的肝脾組織病理變化。
　　4.二聚體的大鼠體內代謝初步研究
　　采用HPLC-HRMSn技術對二聚體和DHA的體內代謝進行初步研究。通過對比二聚體組與空白組、DHA對照組的大鼠體內代謝情況的異同，初步推斷二聚體在體內的可能代謝產物和代謝途徑，并與DHA的體內代謝進行比對。
　　結果：
　　1.二聚體的合成及理化表征
　　HR-MS、1H-NMR圖譜解析表明合成的二聚體結構正確無誤，其收率約為

6、75%，熔點為160.5℃～161℃，且其純度大于98%。SXRD分析表明合成產物為非對稱型二聚體，即為 a dimer ofα- andβ-DHA: bis(3,6,9-trimethyl-3,12-epidioxy-3,4,5,5a,6,7,8,8a,9,10-decahydro-12H-pyrano[4,3-j][1,2] benzodioxepin-10-yl) ether。二聚體 LC-MS/MS含量測定方法的精密度小于5.5

7、8%；準確度為98.54%～105.70%；基質效應和提取回收率均為96.21%～104.11%。二聚體在各環(huán)境中孵育24 h后，剩余濃度百分比分別為69.94%±3.37%（血漿）、85.54%±1.40%（培養(yǎng)基）、76.95%±0.61%（pH4.0）、76.86%±1.75%（pH6.8）、80.94%±0.65%（pH7.4）、85.75%±0.68%（pH8.0）。二聚體在pH1.2緩沖液中反應6 h，幾乎完全降解，并鑒定到

8、主要降解產物為α-DHA和β-DHA。二聚體的平衡溶解度分別為（54.02±3.36）μg/ml（純化水）、（128.79±9.31）μg/ml（pH4.0）、（230.33±17.79）μg/ml（pH5.0）、（313.76±17.32）μg/ml（pH6.8）、（425.94±35.07）μg/ml（pH7.4）、（466.06±21.76）μg/ml（pH8.0），表觀油水分配系數(shù)lgP分別為1.55±0.19（純化水）、1.1

9、2±0.05（pH4.0）、1.41±0.28（pH5.0）、1.48±0.20（pH6.8）、1.36±0.02（pH7.4）、1.22±0.26（pH8.0）。
　　2.二聚體的體外抗瘧活性
　　給藥組對惡性瘧原蟲3D7增殖的抑制作用隨濃度的增加而增強，呈濃度依賴性。二聚體的IC50值（（0.51±0.12）nmol/L）明顯小于DHA的IC50值（（1.81±0.70）nmol/L）（P<0.001），二聚體的IC95

10、值為（4.72±1.86）nmol/L，也小于DHA的IC95值（（6.40±2.05）nmol/L）（P<0.05）。
　　3.二聚體的體內藥效學
　　灌胃給藥，停藥1 d后，測得的二聚體ED50值（（0.44±0.03）mg/kg/d）和ED90值（（1.95±0.10）mg/kg/d）均顯著小于DHA的ED50值（（0.76±0.03） mg/kg/d）和ED90值（（4.15±0.32）mg/kg/d）（P<0.00

11、1）。尾靜脈給藥后，二聚體的ED50（（0.18±0.03）mg/kg/d）和ED90（（0.83±0.08）mg/kg/d）分別顯著低于DHA的ED50（（0.32±0.03）mg/kg/d）和ED90（（1.87±0.11）mg/kg/d）（P<0.001）。兩種途徑給藥后，給藥組對約氏鼠瘧的抑制作用均呈劑量依賴性。除正?？瞻祝ú桓腥荆┙M外，其余各組小鼠的體重都呈降低趨勢，但給藥劑量越大，體重降低量越少。灌胃給藥（7.80、15.6

12、 mg/kg/d）后，二聚體組的轉陰率（75%、100%）明顯高于DHA組（37.5%、62.5%）（P<0.001）。尾靜脈注射給藥（3.0、6.0 mg/kg/d）后，二聚體組的轉陰率（62.5%、100%）顯著高于DHA組（37.5%、50%）（P<0.001）。停藥一周，給予相同劑量的二聚體組小鼠的感染率顯著低于DHA組（P<0.001）。
　　停藥一個月，灌胃二聚體（15.6 mg/kg/d）組小鼠的復燃率為50%，存活

13、率為75%。尾靜脈二聚體（3.0、6.0 mg/kg/d）組小鼠的復燃率分別為60%、25%，存活率分別為62.5%、100%。灌胃和尾靜脈DHA組小鼠的復燃率均為100%，存活率為0。所有存活下來的小鼠體重均顯著增加，且無明顯肝脾病變現(xiàn)象。4.二聚體的大鼠體內代謝初步研究
　　在灌胃DHA后的大鼠體內檢測到18種可能代謝產物，包括11種Ⅰ相代謝產物和7種Ⅱ相代謝產物，Ⅰ相代謝物主要為DHA過氧橋斷裂為單氧橋、羥基化和羰基化代謝產

14、物，Ⅱ相代謝產物則為Ⅰ相代謝物的葡萄糖醛酸結合型代謝物。代謝產物主要出現(xiàn)在尿液和膽汁中。在給予二聚體后的大鼠體內檢測到27種可能產物，其中包括DHA和11種DHA相關代謝產物，其余15種可能產物的代謝途徑主要為過氧橋斷裂為單氧橋、羥基化、羥基化脫水等，產物主要經糞便、尿液、膽汁排出。
　　結論：
　　1、成功合成非對稱型DHA二聚體，化學名稱為a dimer ofα-andβ-DHA:bis(3,6,9-trimethyl-

15、3,12-epidioxy-3,4,5,5a,6,7,8,8a,9,10-decahydro-12H-pyrano[4,3-j][1,2] benzodioxepin-10-yl) ether。該化合物在水中溶解度較小，在pH4.0～8.0范圍內，二聚體較穩(wěn)定，且其平衡溶解度和穩(wěn)定性均隨pH的增大而增加，表觀油水分配系數(shù)呈先增大（pH4.0～6.8）后減?。╬H6.8～8.0）的趨勢。二聚體在培養(yǎng)基中穩(wěn)定，但在血漿中易降解，在pH1.2

16、的緩沖液中極其不穩(wěn)定，迅速降解成α-DHA和β-DHA。
　　2、體外藥效學研究結果顯示，給藥組對惡性瘧原蟲3D7增殖的抑制作用隨濃度的增加而增強。二聚體的IC50和IC95值均明顯低于DHA，可知二聚體的抗瘧活性優(yōu)于DHA。
　　3、瘧鼠體內藥效學研究結果顯示，兩種途徑給藥后，各給藥組對約氏鼠瘧的抑制作用隨劑量的增加而增強。二聚體的抗瘧活性明顯好于DHA。停藥一個月，二聚體的復燃率低于DHA，轉陰率和治愈率均高于DHA。<