甘露聚糖結合凝集素對T淋巴細胞免疫功能調節(jié)作用的初步研究.pdf

1、天然免疫系統(tǒng)是由多種識別及效應分子組成的復雜的網(wǎng)絡結構,通過模式識別受體如Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR)、肽聚糖識別蛋白、甘露聚糖結合凝集素(mannan-binding lectin,MBL)等識別病原相關分子模式(pathogenassociated molecular patterns,PAMPs),構成機體抗感染的第一道防線；并通過抗原提呈、提供共刺激信號和調節(jié)細胞因子的分泌,啟動獲得性免疫應答并

2、指導其應答的性質和強度。天然免疫對獲得性免疫應答的指導作用特別是其分子機制,近年來一直是免疫學研究的熱點之一。
　　 MBL是由肝細胞分泌的高度保守的血漿蛋白,為C型凝集素超家族中膠凝素(collectins)家族成員。MBL也是一種急性期反應蛋白,在應激(如病原體感染、外科手術等)時,其血漿濃度可升高2～3倍。具有“前抗體”(ante-anlfibody)之稱的MBL通過其糖識別域(carbohydrate recogniti

3、on domain,CRD)廣泛識別分布于多種病原體如細菌、病毒、寄生蟲、真菌等表面的糖結構,包括D-甘露糖、L-鹽藻糖、N-乙酰葡萄糖胺、N-乙酰甘露糖胺等。其膠原樣區(qū)(collagen-likeregion,CLR)結合甘露聚糖相關絲氨酸蛋白酶(MBL-associated serine protease,MASP),激活補體凝集素途徑而發(fā)揮溶破和間接調理功能；或者與吞噬細胞膠凝素受體結合,以不依賴補體的方式啟動調理吞噬。MBL結構

4、基因的3個點突變(CGT52TGT、GGC54GAC和GGA57GAA)以及啟動子和5’非翻譯區(qū)突變所致血漿MBL低下而引起的調理吞噬缺損為迄今所發(fā)現(xiàn)的最常見的遺傳性免疫缺損病。MBL缺損者終生處于高度的感染風險之中,隨時可患各種感染甚至威脅生命的感染,亦易患自身免疫性疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風濕關節(jié)炎、Sj(o)gren's綜合征等；而凝集素途徑活性過強時則可能導致炎癥性損傷。
　　 隨著對MBL研究的不斷深入,發(fā)現(xiàn)其除了可識

5、別并清除病原體,還具備許多內源性功能(endogenous functions),如結合自身免疫球蛋白；識別缺血再灌注損傷中暴露的自身抗原或疾病狀態(tài)下修飾的自身抗原；參與對凋亡細胞的吞噬；結合腫瘤細胞并發(fā)揮MBL依賴性細胞介導的細胞毒作用；抑制DC特異性結合細胞間黏附分子3的非整合素(DC-specific intercellular adhesion molecule3-grabbing nonintegrin,DC-SIGN)介導的

6、人類免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiency virus,HIV)對T細胞的感染。因此,MBL作為固有免疫中具有多重功能的模式識別分子,不僅僅參與機體的天然免疫防御,很可能在天然免疫與獲得性免疫之間的相互作用中亦發(fā)揮作用。研究MBL與獲得性免疫的關系,具有重要的科學意義和潛在的醫(yī)學實踐意義。然而,目前國際上對MBL與獲得性免疫的關系尚未涉及,其免疫調節(jié)作用的研究極少,僅見Fraser等報道,MBL可抑制細菌脂多糖(lip

7、opolysaccharide,LPS)刺激的Mo分泌IL-1而促進其產(chǎn)生IL-10、IL-6；Downing等也發(fā)現(xiàn)MBL可與B淋巴細胞結合,認為MBL作為急性期反應蛋白,在炎癥發(fā)生時,可能在血管外與自身細胞結合,參與抗炎反應。而有關MBL與T淋巴細胞之間的相互作用,目前尚未見報道。
　　 本課題組在MBL免疫調節(jié)作用的研究中發(fā)現(xiàn),人外周血Mo經(jīng)常規(guī)的GM-CSF+IL-4培養(yǎng),將其誘導為未成熟DC后,施以MBL可刺激DC分化

8、成熟,包括其表面分子CD1a、CD83、CD40、CD80、CD86和MHC-DR表達上調,吞噬酵母多糖顆?；钚越档?激發(fā)初始T細胞增殖的能力增強,分泌IL-12增多；但存在LPS時,MBL則以劑量依賴方式抑制其誘導的DC分化成熟,包括下調DC的CD83和CD86表達,增強其攝取酵母多糖顆粒的能力,降低其激發(fā)初始T細胞增殖的活性,抑制其LPS誘導的TNF-α和IL-12 p40+p70分泌,這種作用與MBL阻斷LPS-TLR4結合而降低

9、NF-κB活性有關。我們還發(fā)現(xiàn)了MBL與獲得性免疫直接聯(lián)系的初步證據(jù):MBL可與B細胞系Raji細胞以鈣離子依賴方式結合,且高濃度MBL可以抑制Raiji的增殖,提示在應急狀態(tài)下,血液及局部組織MBL濃度增加,不僅可以發(fā)揮天然免疫作用,而且可以結合自身淋巴細胞,進而調控獲得性免疫應答的發(fā)生和發(fā)展。
　　 為進一步研究MBL對獲得性免疫的調節(jié)作用,本課題以T細胞為切入點,初步探索MBL對T細胞功能活性的影響及其分子機制。我們首先從

10、新鮮冰凍人血漿中提取高純度的具有生物學活性的天然MBL,進而探討MBL對T細胞激活劑刀豆蛋白A(ConA)、抗CD3單抗(anti-CD3 mAb)、抗CD3單抗+抗CD28單抗(anti-CD3 mAb+anti-CD28 mAb)活化的人外周血單個核細胞(peripheralblood mononuclear cell,PBMC)以及純化T細胞的增殖及分泌細胞因子的影響,并初步探討了MBL對T細胞直接和間接免疫調節(jié)功能的機制。

11、>　　 第一章 MBL對PBMC增殖及分泌細胞因子的調節(jié)作用
　　 隨著天然免疫研究的深入,發(fā)現(xiàn)膠凝素家族的一些成員和獲得性免疫之間的聯(lián)系越來越緊密。如表面活性物質-A(surfactant protein A,SP-A),表面活性物質-D(surfactant protein D,SP-D)不僅可與病原體結合,參與天然免疫防御功能,亦可與多種免疫細胞如單核細胞、樹突狀細胞、T細胞結合,調節(jié)獲得性免疫應答。SP-A和SP-D可

12、直接抑制T細胞增殖及其功能,避免由于免疫應答過強造成的肺部損傷。MBL也已證實可與多種免疫細胞結合,調節(jié)細胞因子的分泌。根據(jù)以上研究結果,以及MBL與SP-A、SP-D的同源性,尤其是其與SP—A在結構上的高度相似,推測MBL很有可能參與獲得性免疫應答。本部分工作是研究MBL對T細胞激活劑誘導的PBMC增殖及分泌細胞因子是否有調節(jié)作用。
　　 首先用傳統(tǒng)方法從人冰凍血漿中提取MBL。在提取過程中會污染脂多糖(lipopolysa

13、ccharide,LPS),為排除LPS對研究MBL調節(jié)功能的干擾作用,應用多粘菌素B凝膠柱去除LPS,經(jīng)配體結合實驗鑒定,MBL仍保持良好的甘露聚糖(mannan)結合活性。
　　 取人新鮮外周抗凝血,Ficoll-Hypaque密度梯度離心法分離PBMC,用含10％胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng),同時加入T細胞激活劑ConA、anti-CD3 mAb和不同濃度MBL,于

14、37℃,5％CO2培養(yǎng)。CCK-8法檢測PBMC增殖；酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbence assay,ELISA)檢測細胞因子的分泌。在流式細胞術(flow cytometry,FCM)分析中,預先將PBMC標記熒光染料乙酰乙酸琥珀酰亞胺酯(Carboxyfluoresceindiacetatesuccinimidylester,CFDA-SE,CFSE)(2.5μM)后,加入anti-CD3 m

15、Ab和MBL,培養(yǎng)4d后,收集細胞,標記APC-anti-human CD4和PE-anti-human CD8,分析CD4+T細胞和CD8+T細胞的增殖動力學模型。CCK-8法結果表明,MBL可明顯抑制anti-CD3 mAb誘導的PBMC增殖。FCM結果可見,MBL可抑制anti-CD3mAb誘導的PBMC中CD4+T細胞和CD8+T細胞的增殖。ELISA結果顯示,不同濃度MBL均抑制Con A誘導的PBMC分泌IL-2、IL-10

16、與IFN-γ,但明顯上調IL-6分泌?？筂BL—MASP mAbs可阻斷MBL對IL-2、IFN-γ分泌的抑制作用。以上結果提示MBL可抑制T細胞的增殖與活化,為進一步研究MBL對純化T細胞功能的直接調節(jié)作用奠定了基礎。
　　 第二章 MBL對純化T細胞增殖及分泌細胞因子的調節(jié)作用
　　 由于PBMC細胞成分的復雜性,無法根據(jù)上述結果判斷MBL是直接抑制T細胞活性,還是通過其它免疫細胞如抗原提呈細胞(antigen-pr

17、esenting cell,APC)間接抑制T細胞功能,或二者兼有。本部分工作即分離純化T細胞,旨在探討MBL對T細胞增殖及活化的直接調節(jié)作用。
　　 無菌分離人外周血PBMC,磁式細胞分選器(magnetic activated cell sortor,MACS)負選法純化CD3+T細胞、CD4+T細胞,培養(yǎng)于Con A+MBL的培養(yǎng)基中,培養(yǎng)72h,CCK-8法檢測細胞增殖。在FCM分析中,預先將T細胞標記CFSE后,加入a

18、nti-CD3 mAb、anti-CD3 mAb+anti—CD28mAb和MBL,培養(yǎng)4d后檢測CD4+T細胞和CD8+T細胞的增殖。ELISA檢測MBL在不同時間、對不同劑量的T細胞激活劑誘導T細胞分泌Th1型細胞因子(IL-2、IFN-γ)、Th2型細胞因子(IL-6、IL-10),以及IL-17a的影響。CCK-8法結果表明,MBL可抑制Con A誘導的T細胞增殖。FCM結果分析,MBL可抑制anti-CD3 mAb、anti-

19、CD3 mAb+anti—CD28mAb刺激的CD4+T細胞和CD8+T細胞的增殖。ELISA結果顯示,在不同時間,MBL均抑制不同劑量的T細胞激活劑ConA和anti—CD3mAb+anti—CD28mAb誘導的T細胞分泌IL-2、IL-10、IFN-γ、IL-17a,對IL-6分泌則呈現(xiàn)為正負調節(jié)作用。MBL還可抑制ConA誘導的CD4+T細胞分泌IFN-γ。以上結果為MBL直接調節(jié)T細胞功能的推斷提供了實驗依據(jù)。尚需要進一步解決的

20、問題是:MBL是否通過直接與T細胞結合而發(fā)揮調節(jié)作用及其結合特性的測定；與T細胞結合所涉及MBL結構域的初步確定(C型凝集素樣結構域或膠原樣區(qū))；MBL對T細胞活化的影響；MBL是否還可通過調節(jié)APC分泌細胞因子而間接抑制T細胞的功能。
　　 第三章 MBL對T細胞調節(jié)功能的機制初探
　　 為初步探討MBL對T細胞免疫調節(jié)功能的機制,首先采用細胞ELISA(Cell-ELISA)和FCM研究MBL與T細胞及Jurkat細

21、胞的結合,以及anti-CRDmAb、anti-MBL-MASP mAb對MBL與T細胞結合的影響。FCM分析MBL對T細胞活化標志CD69和HLA-DR表達的影響。向含有T細胞激活劑和MBL的培養(yǎng)基中加入10mM Ca++,ELISA檢測INF-γ、IL-2的分泌,以明確Ca++對MBL功能的影響。在阻斷實驗中,將Con A、MBL與anti-MBL-CRD mAb或甘露聚糖(mannan)共同孵育,ELISA檢測IFN-γ的分泌。為

22、明確MBL對T細胞的抑制作用是否為IL-2依賴途徑,在培養(yǎng)基中加入重組人IL-2(recombinant humanIL-2,rhIL-2)(100IU/ml),ELISA檢測IFN-γ的分泌。細胞ELISA和FCM結果均表明,MBL可直接與T細胞以不依賴鈣離子的方式結合,anti-MBL-CRD mAb對二者的結合沒有影響,而可特異性識別MBL-CLR區(qū)的anti-MBL-MASP mAb可抑制MBL與T細胞結合；ELISA結果顯示,

23、外源性Ca++對MBL抑制IFN-γ、IL-2的分泌沒有影響,anti-MBL-CRD mAb和甘露聚糖均不能阻斷MBL對IFN-γ分泌的抑制作用。以上結果均提示MBL對T細胞的直接調節(jié)作用是通過其CLR區(qū)而非CRD區(qū)。MBL與ConA共同刺激T細胞,T細胞早期活化標志CD69表達下降,晚期活化標志HLA-DR表達沒有明顯改變；外源性IL-2可阻斷MBL的抑制作用,提示MBL通過抑制T細胞活化而非誘導T細胞凋亡而發(fā)揮抑制作用。
　

24、　 為探討MBL對APC分泌細胞因子的影響,將LPS與MBL同時加入PBMC,ELISA檢測細胞培養(yǎng)上清中炎癥細胞因子(TNF-α、IL-6)以及趨化性細胞因子(MCP-1)的表達。或者在體外誘導DC的過程中加入MBL,ELISA檢測細胞培養(yǎng)上清中IL-6的分泌。ELISA結果顯示,MBL可抑制LPS刺激PBMC分泌TNF-α及MCP-1,促進IL-6分泌；MBL可抑制LPS或TNF-α誘導的成熟DC分泌IL-6,并抑制不成熟DC分泌

25、IL-6。以上結果提示MBL可能通過抑制APC分泌炎癥細胞因子,進而抑制T細胞功能。具體機制目前正在研究中。
　　 綜上,本課題研究發(fā)現(xiàn),MBL可抑制由T細胞激活劑誘導的PBMC及T細胞的增殖及多種細胞因子的分泌,初步獲得了MBL與T細胞結合的直接證據(jù),并提出MBL還可能通過調節(jié)APC分泌細胞因子進而參與對T細胞的調節(jié)。提示MBL在識別外源性抗原或自身凋亡細胞并清除它們的同時,可能向T細胞傳遞抑制信號,避免由于過強的獲得性免疫應

26、答造成的機體損傷。但具體分子機制如MBL對不同活化階段T細胞的調節(jié)作用,T細胞上MBL受體的鑒定,與T細胞結合的MBL結構域的確定,MBL對T細胞活化信號轉導途徑的影響,以及MBL對不同細胞亞群分化及活性的調節(jié),均需更深入系統(tǒng)的研究。下一步工作將進一步研究MBL對不同亞群T細胞如CD4+、CD8+T細胞的活化、增殖及功能的直接調節(jié)作用,并繼續(xù)探索MBL對APC分化與功能及其對T細胞應答的間接調節(jié)作用,揭示天然免疫中重要的模式識別分子MB