假單胞桿菌nahG和辣椒LOX基因克隆及其轉(zhuǎn)化煙草研究.pdf

1、在自然界,植物在生長發(fā)育過程中常常受到各種逆境的脅迫。在植物與各種病原微生物的協(xié)同進化中,已經(jīng)逐漸形成一系列復雜而有效的防御反應機制,包括植物細胞對逆境脅迫的感知、信號傳導及防御反應相關基因的轉(zhuǎn)錄表達改變等環(huán)節(jié)。其中植物應答逆境信號傳遞受到了廣泛的關注,現(xiàn)在已知SA、JA等植物內(nèi)源激素參與了植物應答逆境的信號傳遞,但其作用機制還不是很清楚。為了研究茄科植物防御反應分子機制,剖析JA和SA等內(nèi)源激素在不同下游防御反應中的調(diào)節(jié)作用及其可能機

2、制,本研究選擇脂氧合酶(LOX)和水楊酸羥基酶(nahG)作為靶標,分離了獲得它們的部分或全長cDNA,構建了其表達載體并應用農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化方法獲得了其相應的轉(zhuǎn)基因煙草植株。主要結(jié)果如下:
　　 1、從辣椒UV照射處理的辣椒(Capsicum annuum L.)為材料構建的cDNA文庫中分離獲得LOX基因的陽性cDNA克隆,序列分析結(jié)果表明,該陽性克隆長度為285bp,含有95個氨基酸。其堿基序列和推定氨基酸序列與其他植

3、物上已經(jīng)分離和鑒定的LOX cDNA分別有92％和96％以上的同源性,推測該陽性克隆為辣椒LOX基因全長cDNA的部分序列。
　　 2、從nahG基因原核表達載體中獲得nahG基因的全長aDNA,其長度為1305個堿基,含有435個氨基酸的開放讀碼框,其堿基序列和推定氨基酸序列均與其它微生物上已經(jīng)分離和鑒定的nahG基因有92％以上的同源性,推測該陽性克隆為nahG基因的全長eDNA。
　　 3、分別構建上述LOX基因的

4、RNAi載體和nahG基因的超表達載體,并進行測序驗證。
　　 4、應用農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化方法,分別將上述兩個載體通過遺傳轉(zhuǎn)化導入到煙草K326中,獲得了轉(zhuǎn)基因煙草T0代再牛植株73株,其中54株為PCR陽性植株。RT-PCR顯示,在LOX基因RNAi轉(zhuǎn)基因煙草中的LOX基因的表達受到了抑制,nahG基因在nahG基因超表達轉(zhuǎn)基因煙草中發(fā)生了轉(zhuǎn)錄表達。
　　 以上轉(zhuǎn)基因植株的獲得,為分析候選基因表達與JA和SA信號途徑