慢病毒介導(dǎo)的p21-Waf1 shRNA對(duì)膀胱癌特異性溶瘤腺病毒抗膀胱癌的體外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：在我國(guó)膀胱癌的發(fā)病率一直居于泌尿系統(tǒng)腫瘤的首位，傳統(tǒng)的治療手段因其腫瘤殺傷能力低和副作用大等缺點(diǎn)，故而治療效果遠(yuǎn)未令人滿意。選擇復(fù)制性溶瘤腺病毒治療腫瘤是極其有前途的基因治療腫瘤的方法。為此，本課題組構(gòu)建了膀胱癌特異性溶瘤腺病毒Ad/PSCAE/UPII/E1A，在膀胱癌特異性啟動(dòng)子UPII和增強(qiáng)子PSCAE的控制下，該腺病毒能夠選擇性的在膀胱癌細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制，從而發(fā)揮裂解腫瘤細(xì)胞的效應(yīng)。前期的研究證實(shí)，筆者所構(gòu)建的腺病毒Ad/P

2、SCAE/UPII/E1A，特異性高，其只在膀胱癌細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制，對(duì)于膀胱癌細(xì)胞也有一定的殺傷作用。但UPII啟動(dòng)子的活性相對(duì)較低，往往會(huì)削弱腺病毒的復(fù)制，從而影響其腫瘤殺傷效應(yīng)。p21/Waf1做為一個(gè)經(jīng)典的細(xì)胞周期抑制蛋白，近年來(lái)確由于在腺病毒介導(dǎo)的基因治療中的拮抗作用而受到廣泛關(guān)注，但p21/Waf1對(duì)膀胱癌特異性溶瘤腺病毒的作用卻不得而知。因此，本研究構(gòu)建了p21/Waf1shRNA的慢病毒表達(dá)載體，并建立了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染p21/Wa

3、f1shRNA的人膀胱癌細(xì)胞株EJ和5637，檢測(cè)p21/Waf1對(duì)膀胱癌特異性溶瘤腺病毒的腫瘤殺傷效應(yīng)、病毒復(fù)制、UPII啟動(dòng)子的活性及誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡的影響，并初步探討了可能的作用機(jī)制，為p21/Waf1能否作為膀胱癌基因治療的一個(gè)新靶點(diǎn)提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：（1）構(gòu)建人p21/Waf1的慢病毒干擾載體。設(shè)計(jì)針對(duì)p21/Waf1shRNA的序列，插入含GFP的pMagic7.1載體，通過(guò)PCR和DNA測(cè)序技術(shù)對(duì)重組克

4、隆進(jìn)行鑒定，將重組病毒質(zhì)粒和輔助包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞進(jìn)行病毒包裝，并對(duì)病毒滴度進(jìn)行檢測(cè)。將表達(dá)p21/Waf1shRNA的慢病毒轉(zhuǎn)染EJ和5637細(xì)胞，以嘌呤霉素進(jìn)行篩選，直到獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)入p21/Waf1shRNA的EJ和5637細(xì)胞，檢測(cè)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞中p21/Waf1的表達(dá)。（2）p21/Waf1對(duì)Ad/PSCAE/UPII/E1A腫瘤殺傷效應(yīng)的影響。應(yīng)用MTT比色法檢測(cè)p21/Waf1敲減后腺病毒對(duì)人膀胱癌細(xì)胞株EJ和5637體外

5、增殖效應(yīng)的影響。（3）p21/Waf1對(duì)Ad/PSCAE/UPII/E1A滴度的影響。利用腺病毒滴度快速檢測(cè)法檢測(cè)p21/Waf1敲減后腺病毒滴度的變化；檢測(cè)與病毒復(fù)制密切相關(guān)的指標(biāo)E1A和hexon的表達(dá)。（4）p21/Waf1對(duì)UPII啟動(dòng)子活性的影響。首先檢測(cè)p21/Waf1對(duì)EJ和5637細(xì)胞中AR表達(dá)水平的影響；接下來(lái)利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將攜帶熒光素酶報(bào)告基因的重組質(zhì)粒Rp-PSCAE-UPII-Luc分別轉(zhuǎn)染EJ和5637細(xì)

6、胞，以pCMV-β-gal作為內(nèi)對(duì)照，熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)p21/Waf1敲減后UPII啟動(dòng)子活性的變化。（5）p21/Waf1對(duì)Ad/PSCAE/UPII/E1A誘導(dǎo)凋亡的影響。利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)p21/Waf1敲減后Ad/PSCAE/UPII/E1A對(duì)EJ和5637凋亡的影響，分析凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)因子的表達(dá)。
　　結(jié)果：（1）成功構(gòu)建了表達(dá)p21/Waf1shRNA的重組慢病毒載體，獲得滴度為4.12×108Tu/ml的慢

7、病毒。（2）慢病毒的轉(zhuǎn)染效率均>90％，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染p21/Waf1shRNA的EJ和5637細(xì)胞，p21/Waf1shRNA能顯著降低EJ和5637細(xì)胞中p21/Waf1的表達(dá)。（3）Ad/PSCAE/UPII/E1A對(duì)p21/Waf1敲減的EJ和5637細(xì)胞增殖的抑制效應(yīng)明顯增強(qiáng)。（4）p21/Waf1敲減的EJ和5637細(xì)胞中腺病毒的滴度顯著增強(qiáng)。（5）在p21/Waf1敲減的EJ和5637細(xì)胞中，腺病毒復(fù)制的相關(guān)指標(biāo)E1A和he

8、xon的表達(dá)明顯上調(diào)。（6）在p21/Waf1敲減的EJ和5637細(xì)胞中AR的表達(dá)明顯上調(diào)；熒光素酶活性檢測(cè)顯示，p21/Waf1敲減后的細(xì)胞內(nèi)Luc的活性顯著增強(qiáng)。（7）Ad/PSCAE/UPII/E1A均能誘導(dǎo)EJ和5637細(xì)胞發(fā)生凋亡，p21/Waf1敲減后的細(xì)胞凋亡顯著增加。（8）Ad/PSCAE/UPII/E1A可以通過(guò)上調(diào)Fas、Bax、caspase3、caspase8的表達(dá)，下調(diào)Bcl-2的表達(dá)促進(jìn)EJ和5637細(xì)胞發(fā)生

9、凋亡；但EJ和5637的野生型細(xì)胞和p21/Waf1敲減的細(xì)胞相比時(shí)，在p21/Waf1敲減組中，F(xiàn)as、caspase3、caspase8的表達(dá)上調(diào)，而B(niǎo)ax和Bcl-2的表達(dá)與野生型細(xì)胞相比無(wú)明顯變化。
　　結(jié)論：（1）成功構(gòu)建了表達(dá)p21/Waf1shRNA的重組慢病毒，且能有效感染膀胱癌細(xì)胞EJ和5637。（2）慢病毒介導(dǎo)的p21/Waf1shRNA能顯著降低EJ和5637細(xì)胞中p21/Waf1的表達(dá)。（3）在p21/Wa