LncRNA在椎間盤退變過程中調(diào)控髓核細胞凋亡的功能及其機制研究.pdf

1、目的：
　　椎間盤的老化和退變是脊柱退變性疾病發(fā)生的前提條件和病理基礎(chǔ)，理解椎間盤老化和退變的生物學(xué)機制，開發(fā)有效的治療干預(yù)措施以應(yīng)對椎間盤退變帶來的健康問題已經(jīng)成為當前和未來全球性醫(yī)學(xué)難題之一。本研究通過生物信息學(xué)分析篩選髓核細胞凋亡調(diào)控相關(guān)的lncRNA，進而探索lncRNA在椎間盤退變過程中髓核細胞凋亡調(diào)控的分子機制，從而為尋找椎間盤退變性疾病治療的新靶點提供科學(xué)指導(dǎo)。
　　方法：
　　1、比較三種生物信息學(xué)分析

2、軟件，應(yīng)用TargetScan軟件篩選可能通過miR-155參與髓核細胞凋亡調(diào)控的lncRNA。2、RT-PCR檢測髓核細胞轉(zhuǎn)染miR-155mimics后lncRNA表達調(diào)控情況，通過lncRNA及mRNA芯片檢測評估髓核細胞轉(zhuǎn)染miR-155過表達慢病毒后lncRNA及mRNA表達譜變化，評估m(xù)iR-155作為基因治療靶點可能對髓核細胞功能產(chǎn)生的影響。3、流式細胞分析檢測過表達GAS5 lncRNA后髓核細胞的凋亡情況，Wester

3、n Blot檢測線粒體通路上兩個關(guān)鍵凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3和Bcl-2的表達，驗證GAS5 lncRNA對髓核細胞凋亡調(diào)控的影響，探索GAS lncRNA參與髓核細胞凋亡調(diào)控的可能機制。
　　結(jié)果：
　　1、退變椎間盤髓核組織內(nèi)共有631個表達上調(diào)的lncRNA序列信息較為明確，其中有148個上調(diào)的lncRNA包含了178個hsa-miR-155-5p結(jié)合位點。符合TargetScan評分標準的lncRNA有16個，

4、NR_002819含有6個hsa-miR-155-5p結(jié)合位點，ENST00000511037、NR_027451包含了5個結(jié)合位點，19個lncRNA包含了2個結(jié)合位點，126個lncRNA包含了1個結(jié)合位點。2、GAS5 lncRNA包含了1個hsa-miR-155-5p結(jié)合位點，外源性導(dǎo)入hsa-miR-155 mimics72小時后，髓核細胞GAS5 lncRNA表達較陰性對照組明顯下降（P＜0.05）。lncRNA及mRNA表

5、達譜芯片分析共發(fā)現(xiàn)721個差異表達lncRNA（Fc值≥2，P＜0.05），其中492個lncRNA表達上調(diào)，229個lncRNA表達下調(diào)。芯片檢測的18個GAS5 lncRNA轉(zhuǎn)錄本均表達下調(diào)，僅有GAS5-021表達具有顯著差異（Fc值≥1.5，P＜0.05）。Gene Ontology分析顯示，髓核細胞在miR-155過表達后基因表達發(fā)生了明顯的改變，主要集中在腫瘤、免疫性疾病、退變性疾病及心血管疾病等領(lǐng)域，其中以強直性脊柱炎及滑

6、膜炎與椎間盤的關(guān)系最為密切。3、GAS5 lncRNA過表達慢病毒轉(zhuǎn)染96小時后，髓核細胞GAS5 lncRNA的表達水平提高(P＜0.05)，凋亡蛋白酶Caspase-3表達上調(diào)，凋亡抑制蛋白Bcl-2表達下調(diào)，髓核細胞的凋亡率較陰性對照組明顯升高(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　lncRNA在退變椎間盤髓核細胞凋亡調(diào)控中起到了重要作用，GAS5 lncRNA過表達使得髓核細胞內(nèi)線粒體凋亡通路上的兩個關(guān)鍵蛋白家族成員的表